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烟曲霉孢子暴露对支气管哮喘气道粘膜免疫功能

来源:论文帮手 作者: 发布日期:2017-12-09 11:49:41

 

 
烟曲霉孢子暴露对支气管哮喘气道粘膜免疫功能以及气道微环境的影响
摘要
烟曲霉(Aspergillus fumigatus,A. fumigatus)是一种广泛存在于环境中的重要的条件致病菌,其微小的孢子结构使之吸入易于到达宿主肺泡,通过菌丝生长而定植于气道内或引发侵袭性感染。烟曲霉还是一种重要的外源性过敏原,流行病学研究显示,烟曲霉致敏是支气管哮喘(以下均简称哮喘)加重的危险因素。根据哮喘全球倡议(The Global Initiative for Asthma,GINA)指南,吸入性糖皮质激素和β2肾上腺素能受体激动剂是控制哮喘症状的主要药物,但部分哮喘患者即使根据规范化GINA指南诊治,哮喘症状仍控制不佳或反复发作,而联合抗真菌药物伊曲康唑尝试性治疗后,哮喘症状及肺功能较前明显改善。本实验从动物哮喘模型入手,一方面阐述烟曲霉导致难治性哮喘的可能性机制,另一方面初步探索激素和抗生素干预对烟曲霉气道定植以及气道微环境的影响。
 
第一章 烟曲霉孢子暴露对支气管哮喘大鼠肺组织糖皮质激素受体和β2肾上腺素能受体表达的影响
目的探讨烟曲霉孢子暴露对哮喘大鼠肺组织内GCR和ADRB2表达的影响。
方法32只Wistar大鼠随机分为4组:空白对照组(CON组)、单纯孢子组(CON+AF组)、单纯哮喘组(OVA组)、哮喘+孢子组(OVA+AF组)。OVA组和OVA+AF组均以卵清白蛋白(OVA)致敏、激发的方法构建哮喘模型,CON组和CON+AF组则以生理盐水(NS)作对照处理;在最后一次激发24 h后,CON+AF组和OVA+AF组给予烟曲霉孢子鼻腔滴入。通过气道高反应性Penh值、肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞百分比(Eos%)及血清IgE水平确定哮喘模型的建立,HE染色观察各组大鼠肺组织病理变化,qRT-PCR和Western blot法检测大鼠肺组织GCR和ADRB2的表达。
结果短期烟曲霉孢子吸入后,哮喘+孢子组大鼠与单纯哮喘组大鼠比较,前者的Penh值、BALF中Eos%、血清IgE水平均在一定程度上高于后者,其中Penh值在乙酰甲胆碱浓度为25 g/L、50 g/L激发时显著高于单纯哮喘组(P<0.05)。与单纯哮喘组比较,哮喘+孢子组大鼠肺组织的GCR表达水平显著降低(GCR mRNA:OVA+AF组0.52±0.08 vs OVA组0.72±0.22,P<0.05;GCR蛋白:OVA+AF组59.09±7.60 vs OVA组81.88±15.41,P<0.05);各组间ADRB2表达水平无显著差异。
结论短期烟曲霉孢子吸入降低哮喘大鼠肺组织GCR的表达,而对ADRB2的含量无显著影响,这可能是糖皮质激素抵抗型哮喘发生的重要机制之一。该结果提醒我们,在诊治反复发作的激素抵抗型哮喘患者时,需警惕是否存在环境中烟曲霉暴露或气道烟曲霉定植。
 
第二章 地塞米松/头孢曲松钠干预对烟曲霉气道定植以及气道微环境的影响
目的  探讨长期地塞米松/头孢曲松钠干预对烟曲霉气道定植以及气道微环境的影响。
方法  56只Wistar大鼠随机分为7组:空白对照组(CON组)、单纯孢子组(CON+AF组)、单纯哮喘组(OVA组)、哮喘+孢子组(OVA+AF组)、地塞米松干预组(OVA+DEX+AF组)、头孢曲松钠干预组(OVA+CEF+AF组)、联合干预组(OVA+DEX/CEF+AF组)。采用OVA致敏、激发的方法构建哮喘模型,采用烟曲霉孢子悬液滴鼻的方法模拟烟曲霉暴露。药物干预组均于1% OVA激发前30 min腹腔注射给药(每周一、三、五)。测定大鼠气道反应性指标sRaw变化值,肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸粒细胞百分比(Eos%)及血清IgE。检测大鼠肺泡灌洗液及血中pH值、电解质、总蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)及酸性磷酸酶(ACP)含量,ELISA法及qRT-PCR法检测大鼠肺组织IL-33的表达,马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养法和过碘酸乌洛托品银染色(Periodic Acid-Silver Methenamine, PASM)法观察气道和肺实质内烟曲霉孢子滞留和定植情况。
结果(1)与单纯哮喘组比较,哮喘+孢子组大鼠血中K+水平降低(OVA+AF组6.5±0.59 vs OVA组 7.7±1.35,P>0.05)、BALF中K+水平上升(OVA+AF组2.39±0.38 vs OVA组 2.04±0.19,P>0.05),血和BALF二者间的K+浓度差具有统计学差异(OVA+AF组4.12±0.35 vs OVA组 5.74±0.53,P<0.05);与哮喘+孢子组比较,地塞米松干预组、头孢曲松钠干预组和联合干预组血和BALF中K+水平无明显改变。(2)与单纯哮喘组比较,哮喘+孢子组大鼠血清和BALF中的总蛋白量明显增加(血清总蛋白:OVA+AF组 1988±62 vs OVA组 1635±94,P<0.05;BALF总蛋白:OVA+AF组 8.92±0.33 vs OVA组 4.66±0.62,P<0.01);头孢曲松钠干预组和联合干预组血清和BALF中的总蛋白量较哮喘+孢子组均明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。(3)单纯哮喘组组BALF中IL-33含量和肺组织中IL-33 mRNA的表达均显著高于空白对照组,给予烟曲霉孢子吸入后,哮喘+孢子组IL-33水平较单纯哮喘组有上升趋势,但差异无统计学意义;与哮喘+孢子组相比,地塞米松干预组和联合干预组BALF中IL-33含量和肺组织中IL-33 mRNA的表达均明显减少,差异具有统计学意义;头孢曲松钠干预组的IL-33水平较哮喘+孢子组也有下降趋势。(4)各组大鼠血清和BALF中的pH值、Na+、Cl-、Ca2+水平及LDH、ACP活力无显著性差异。(5)地塞米松干预可在一定程度上降低哮喘大鼠小气道阻力sRaw值、BALF中的Eos%和血清IgE水平,而头孢曲松钠效果不明显。(6)空白对照组、单纯孢子组、单纯哮喘组、哮喘+孢子组、地塞米松干预组、头孢曲松钠干预组、联合干预组肺组织匀浆烟曲霉阳性率分别为0、0、0、50%、100%、50%、67%;BALF烟曲霉阳性率分别为0、0、0、50%、57%、50%、0;肺组织PASM染色可见哮喘+孢子组、地塞米松干预组、头孢曲松钠干预组、联合干预组肺实质内烟曲霉孢子滞留,而单纯孢子组未见此现象。
结论烟曲霉孢子吸入、地塞米松和头孢曲松钠应用对哮喘大鼠血液和气道内微环境有影响,主要表现为血钾降低、气道内蛋白渗出以及IL-33基因表达的改变。地塞米松和头孢曲松钠的应用使气道和肺组织内烟曲霉孢子滞留、难以清除,增加了真菌气道定植和肺内感染的风险,在哮喘治疗中需合理使用糖皮质激素、抗生素等药物,避免真菌二重感染。
 
关键词:曲霉菌,烟;哮喘;受体,糖皮质激素;白介素-33;电解质
 
EFFECTS OF ASPERGILLUS FUMIGATUS SPORES ON AIRWAY IMMUNE FUNCTION AND MICROENVIRONMENT IN A RAT MODEL OF ASTHMA
ABSTRACT
Aspergillus fumigatus(A. fumigatus)is an important conditioned pathogen widely distributed in the environment. Its spore is easily to be inhaled and reaches the alveoli,colonizes in the respiratory tract or induces invasive infection by hyphae growth. A. fumigatus is also a major exogenous allergens. Epidemiologic studies suggest that A. fumigatus sensitization is a significant risk factor for bronchial asthma (hereinafter referred to as asthma) exacerbation. According to the Global Initiative for Asthma (GINA), inhaled corticosteroids and β2-adrenergic receptor agonists (β2-agonists)are regarded as the gold standard of asthma treatment.However, asthma symptoms are still poorly controlled or recurrent with standardized guideline-based therapy while antifungal therapies such as itraconazoleimproved respiratory symptoms. In this project, we detect the possible mechanism of A. fumigatus-related refractory asthma using an animal asthma model. Moreover, we preliminarily explore the influence of dexamethasone/ceftriaxoneintervention on airway microenvironment and A. fumigatus colonization in the respiratory tract.
 
Chapter 1:The effects of A. fumigatus on GCR and ADRB2 expression in a rat model of asthma
Objective: This study was aimed to explore the effect of A. fumigatus on GCR and ADRB2 expression in an asthmatic rat model.
Methods: Wistar rats were randomly divided into 4 groups(n=8):a normal control group (CON), a normal control with A.fumigatus group (CON+AF), an OVA group (OVA), an OVA with A.fumigatus group (OVA+AF).OVA and OVA+AF groups were sensititized and challenged with ovalbumin (OVA) to establish asthmatic model. CON and CON+AF groups were given normal saline as control. After the last challenge, OVA+AF and CON+AF group were given A.fumigatus spores intranasally. The Penh value, eosinophils percentage (Eos%) and serum IgE levels were measured and sections of pulmonary were stained with hematoxylin-eosin (HE). GCR andADRB2 levels in lung tissues were measured by qRT-PCR and Western blot. Potato dextrose agar(PDA)medium culture and Periodic Acid-Silver Methenamine staining (PASM) were used to observe the A.fumigatus colonization in the respiratory tract.
Results:After short-term exposure to A.fumigatus, Eos% in BALF and serum IgE levels in OVA+AF group were slightly higher than the OVA group, and the Penh value was significantly increasedcompare with the OVA group at the concentration of 25 g/L and 50 g/L of methacholine (P<0.05).Compared to the OVA group, the GCR mRNA and protein expression in lung tissues in OVA+AF groups were decreased significantly (GCR mRNA: OVA+AF 0.52±0.08 vs OVA 0.72±0.22, P<0.05;GCR protein: OVA+AF 59.09±7.60 vs OVA 81.88±15.41, P<0.05).There were noobvious changes in the levels of ADRB2 expression after inhalation of A. fumigatus in asthmatic rats.
Conclusion: These findings indicate that A.fumigatus exposure may be involved in glucocorticoids responsiveness by regulating the expression of GCR in asthmatics. A.fumigatus colonization or infection in the respiratory tract should not beignored in patients of steroid-resistant asthma. 
 
Chapter 2: The influence of dexamethasone/ceftriaxoneintervention on the A. fumigatus colonization in therespiratory tract and the changes of airway microenvironment 
Objective: This study was aimed to explore the influence of dexamethasone/ceftriaxoneinterventionon the A. fumigatus colonization in therespiratory tract and the changes of airway microenvironmentin a rat model of asthma.
Methods: Wistar rats were randomly divided into 7 groups(n=8):a normal control group (CON), a normal control with A.fumigatus group (CON+AF), an OVA group (OVA), an OVA with A.fumigatus group (OVA+AF), an OVA with A.fumigatus group which was pretreated with dexamethasone (OVA+DEX+AF), an OVA with A.fumigatus group which was pretreated with ceftriaxone (OVA+CEF+AF), an OVA with A.fumigatus group which was pretreated with dexamethasone and ceftriaxone (OVA+DEX/CEF+AF).Rats were sensitized and challenged with ovalbumin (OVA) to establish asthmatic models,and then were given A.fumigatus spores intranasally. Dexamethasone and ceftriaxone were injected intraperitoneally 30 minutes before OVA challenge. The sRaw value, eosinophils percentage (Eos%) and serum IgE levels were measured. The pH value, electrolyte,lactate dehydrogenase (LDH), acid phosphatase (ACP) and total protein were quantified.IL-33 levels in lung tissues were measured by qRT-PCR and ELISA. Potato dextrose agar(PDA)medium culture and Periodic Acid-Silver Methenamine staining (PASM) were used to observe the A.fumigatussporespresence or colonizationin the respiratory tract.
Results:(1) Compared to the OVA group, the level of K+ in OVA+AF group was decreased in blood (OVA+AF 6.5±0.59 vs OVA 7.7±1.35, P>0.05) and was increased in BALF (OVA+AF 2.39±0.38 vs OVA 2.04±0.19, P>0.05). The difference of K+ between blood and BALF was statistically significant (OVA+AF 4.12±0.35 vs OVA 5.74±0.53,P<0.05). The levels of K+in OVA+DEX+AF group, OVA+CEF+AF group and OVA+DEX/CEF+AF group were similar to the OVA+AF group. (2)Compared to the OVA group, total protein in serum and BALF in OVA+AF group were significantly increased (serum: OVA+AF 1988±62 vs OVA 1635±94,P<0.05;BALF: OVA+AF 8.92±0.33 vs OVA 4.66±0.62,P<0.01). Total protein in serum and BALF in OVA+CEF+AF group and OVA+DEX/CEF+AF group were significantly decreased when compared to the OVA+AF group (P<0.05 or P<0.01). (3) The expression of IL-33 in OVA group was significantly higher than CON group; After inhalation of A.fumigatus spores, the expression of IL-33 was slightly increased in OVA+AF group. IL-33 levels in OVA+DEX+AF group and OVA+DEX/CEF+AF group were significantly decreased when compared to the OVA+AF group. (4) The pH value, Na+, Cl-, Ca2+levels, LDH and ACP vitality have no obvious difference among these groups. (5) Dexamethasone could decrease the sRaw value, Eos% and serum IgE in some degree while ceftriaxone has no obvious effect. (6) The positive rate of A.fumigatusculture in lung tissues in CON groups, CON+AF group, OVA groups, OVA+AF group, OVA+DEX+AF group, OVA+CEF+AF group and OVA+DEX/CEF+AF group were 0, 0, 0, 50%, 100%, 50%, 67%, respectively;The positive rate of A.fumigatusculture in BALF were 0, 0, 0, 50%, 57%, 50%, 0, respectively. PASMstained sectionsfrom OVA+AF groups, OVA+DEX+AF groups, OVA+CEF+AF groups, OVA+DEX/CEF+AF groups showing entire or degraded fungal spores in lung tissue while no fungal spores were found in CON+AF groups.
Conclusion:A.fumigatus inhalation, dexamethasone and ceftriaxone have influences on the microenvironment of the blood and therespiratory tract (manifest as lower blood K+ levels and protein exudation in the lung). Dexamethasone and ceftriaxone lead to A.fumigatusspores remained in the airway, increase the risk of A.fumigatus colonization and infection, and the rational use of drugs should be appreciated to avoid fungal infection. IL-33 could be a potential drug target for treatment of steroid-resistant asthma in the future.
 
KEY WORDS:Aspergillus fumigatus; Asthma; Receptors, glucocorticoid;Interleukin-33; Electrolyte
 
 
目录
摘要…………………………………………………………………………………....3
ABSTRACT…………………………………………………………………………...6
英文缩写一览表……………………………………………………………………..13
引言…………………………………………………………………………………..15
参考文献……………………………………………………………………………..19
第一章 烟曲霉孢子暴露对支气管哮喘大鼠肺组织糖皮质激素受体和β2肾上腺
素能受体表达的调节………………………………………………………22
材料和方法…………………………………………………………………………..22
一、试剂材料与仪器……………………………………………………………..22
(一)实验动物………………………………………………………………..22
(二)烟曲霉菌株……………………………………………………………..22
(三)试剂与材料……………………………………………………………..22
(四)仪器设备………………………………………………………………..24
(五)主要溶液的配制………………………………………………………..24
二、实验方法和步骤……………………………………………………………..25
(一)实验动物分组……………………………………………………………25
(二)哮喘模型的建立…………………………………………………………25
(三)烟曲霉孢子悬液制备……………………………………………………25
(四)烟曲霉菌吸入:滴鼻法…………………………………………………26
(五)气道反应性测定………………………………………………………..26
(六)手术和取材……………………………………………………………..28
(七)BALF白细胞总数和细胞分类计数……………………………………28
(八)血清中IgE测定:ELISA法…………………………………………..29
(九)肺组织病理检查………………………………………………………..30
(十)大鼠肺组织GCR和ADRB2 mRNA检测……………………………32
1. 大鼠肺组织RNA提取:Trizol法…………………………………………32
2. RNA纯度和浓度测定……………………………………………………...32
3. 逆转录合成cDNA………………………………………………………….33
4. 实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)………………………………………33
5. 结果分析……………………………………………………………………34
(十一)大鼠肺组织GCR和ADRB2蛋白质检测…………………….……34
1. 大鼠肺组织蛋白质提取……………………………………………………34
2. 蛋白定量……………………………………………………………………34
3. 蛋白上样和电泳……………………………………………………………35
4. 转膜…………………………………………………………………………36
5. 免疫反应……………………………………………………………………36
结果…………………………………………………………………………………37
一、各组大鼠气道反应性的比较………………………………………………..37
二、 各组大鼠BALF中嗜酸性粒细胞比例………………………………..……38
三、 各组大鼠血清IgE水平…………………………………………………...…38
四、 各组大鼠的气道炎症浸润和病理学观察…………………………………..38
五、 各组大鼠肺组织GCR mRNA和ADRB2 mRNA的相对表达……………40
六、 各组大鼠肺组织GCR蛋白和ADRB2蛋白的相对表达……………….…40
讨论………………………………………………………………………….…….…41
参考文献………………………………………………………………………….….45
第二章地塞米松/头孢曲松钠干预对烟曲霉气道定植以及气道微环境的影响
材料和方法……………………………………………………………………….….49
一、 试剂材料与仪器………………………………………………………….….49
(一) 实验动物………………………………………………………….….49
(二) 烟曲霉菌株……………………………………………………….….49
(三) 试剂与材料……………………………………………………….….49
(四) 仪器设备………………………………………………………….….50
二、 实验方法和步骤………………………………………………………….….50
(一) 动物分组及模型制备…………………………………………….….50
(二) 气道反应性测定……………………………………………………..50
(三) 手术和取材…………………………………………………………..52
(四) 肺组织、BALF、全血烟曲霉培养…………………………..……...52
(五) 肺组织过碘酸乌洛托品银染色(Periodic Acid-Silver Methenamine, PASM)染色………………………………………………..………...52
(六) BALF中嗜酸粒细胞计数及血清IgE水平检测……….…………...53
(七) 全血pH值和电解质测定………………………………………..…..53
(八) BALF和血清中总蛋白浓度测定……………………………….…..53
(九) BALF和血清中乳酸脱氢酶(LDH)测定:微板法………………….54
(十) BALF和血清中酸性磷酸酶(ACP)测定:微板法………………….54
(十一)BALF中IL-33测定:ELISA法…………………………………….55
(十二)肺组织IL-33 RNA mRNA检测……………………………………56
结果……………………………………………………………………………..…58
一、 各组大鼠气道反应性的比较………………………………………………..58
二、 各组大鼠BALF中嗜酸粒细胞比例………………………………………...59
三、 各组大鼠血清IgE水平……………………………………………………...59
四、 烟曲霉在大鼠气道和肺实质内定植的观察………………………………..60
五、 各组大鼠血和BALF中pH值及电解质的含量…………………………….62
六、 各组大鼠血清和BALF中总蛋白、LDH、ACP的含量……………………..62
七、 各组大鼠BALF中IL-33因子和肺组织中IL-33mRNA的表达…………...64
讨论…………………………………………………………………………………..65
参考文献……………………………………………………………………………..69
综述………………………………………………………………………………..…72
在读期间发表论文情况……………………………………………………………..84
致谢………………………………………………………………………………..…85
 
 
英文缩写一览表
英文简称 英文全称 中文名称
ABPA Allergic bronchopulmonary aspergillosis 变应性支气管肺曲霉菌病
ADRB2 β-2 adrenergic receptor β肾上腺素能受体
ACP Acid phosphatase 酸性磷酸酶
A. fumigatus Aspergillus fumigatus 烟曲霉菌
AHR Airway hyperreactivity 气道高反应性
BALF Bronchoalveolar lavage fluid 肺泡灌洗液
bp Base pair 碱基对
β2-agonists β2-adrenergic receptor agonists β肾上腺素能受体激动剂
cDNA Complementary deoxyribonucleic acid 互补DNA
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验
EOS Eosinophil 嗜酸性粒细胞
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
GCR Glucocorticoid receptor 糖皮质激素受体
IgE Immunoglobulin E 免疫球蛋白 E
IPA Invasive pulmonary aspergillosis 侵袭性肺曲霉菌病
IL-33 Interleukin-33 白介素-33
ILC2s Group 2 innate lymphoid cells II型固有淋巴细胞
LDH Lactate dehydrogenase 乳酸脱氢酶
mAb monoclonal antibody 单克隆抗体
Mch Methacholine 乙酰甲胆碱
mRNA Messenger ribonucleic acid 信使核糖核酸
NS Normal saline 生理盐水
OD Optical density 光密度值
OVA Ovalbumin 卵蛋白
PBS Phosphate buffer solution 磷酸盐缓冲溶液
Penh Enhanced pause 增强呼气间歇
qRT-PCR Quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction 定量逆转录聚合酶链反应
rpm Rounds per minute 每分钟转速
SAFS Severe asthma with fungal sensitization 真菌致敏的严重哮喘
SRA Steroid-resistant asthma 激素抵抗型哮喘
sRaw Specific airway resistance 特殊气道阻力
TLR Toll-like receptor Toll样受体
WBP Whole Body Plethysmography 全身体积描记系统
Western Blot Western Blot 蛋白免疫印迹法
 
 
烟曲霉孢子暴露对支气管哮喘气道粘膜免疫功能以及气道微环境的影响
引言
支气管哮喘(哮喘)是一种由嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞等多种炎性细胞参与的气道慢性炎症性疾病。研究结果显示,空气中的真菌孢子与哮喘的致敏、发展以及加重密切相关,常可导致哮喘症状持续不缓解,从而导致门诊、急诊就诊率和住院率的上升,增加医疗、经济及社会负担[1, 2]。烟曲霉作为一种最常见的腐生寄生真菌,广泛存在于周围环境中,由于其孢子直径仅有2~3μm,极易被吸入而到达宿主肺泡。在正常情况下,固有免疫系统可以及时清除吸入的孢子,不会对人体产生威胁,但当免疫功能缺陷时,烟曲霉孢子常可通过菌丝生长而在气道内定植,引起过敏性炎症或引发侵袭性感染。烟曲霉既是重要的条件致病菌,又是重要的外源性过敏原,气道内烟曲霉定植或者机体对烟曲霉过敏是哮喘加重和进展的主要危险因素之一。研究发现急性加重的哮喘患者所居住的室内环境中常有高浓度的烟曲霉孢子存在,并且烟曲霉在气道内的定植与肺功能的恶化有着密切联系[3, 4]。
我们前期对烟曲霉暴露对哮喘大鼠气道炎症及气道高反应性的影响进行了初步研究[5, 6],结果证实慢性烟曲霉暴露可加重慢性哮喘大鼠的气道炎症性改变,增加气道高反应性,随着烟曲霉暴露时间的延长,哮喘大鼠肺泡灌洗液(BALF)中IL-5和IL-13的含量逐渐增加,而INF-γ水平无显著变化,说明烟曲霉暴露主要加重气道的Th2型炎症反应;此外,慢性烟曲霉暴露可诱导哮喘大鼠明显的气道上皮杯状细胞增生和上皮下胶原纤维沉积,上调黏蛋白MUC5AC表达,并诱导时间依赖性IL-13、TGF-β、粒-巨噬细胞集落刺激因子表达,进而导致气道重塑性改变,且该重塑性改变与气道反应性增高呈平行关系。我们还发现,前列腺素D2(prostaglandin D2, PGD2)/Th2细胞上表达的趋化受体同源分子(Chemoattractant receptor-homologous molecule expressed on T-helper type 2 cells, CRTH2)通路在烟曲霉加重哮喘气道嗜酸性炎症及气道高反应性的过程中发挥重要作用,药理阻断PGD2受体-CRTH2可显著改善烟曲霉加重的嗜酸性炎症及气道高反应性。近年来,随着变态反应性支气管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis,ABPA)、真菌致敏性重症哮喘(severe asthma associated with fungal sensitization, SAFS)和变态反应性支气管肺霉菌病(allergic bronchopulmonary mycosis, ABPM)等一系列概念的提出,烟曲霉与重症哮喘及难治性哮喘的联系越来越受到关注。
目前,吸入性糖皮质激素因其良好的抗炎作用而被认为是哮喘的首选治疗方法[7],β2肾上腺素能受体激动剂是控制哮喘症状的重要药物,具有支气管舒张作用[8]。但部分哮喘患者对常规糖皮质激素或β2肾上腺素能受体激动剂治疗效果并不满意。Vicencio[9]等人报道了一例儿童难治性哮喘的病例,给予该患者高剂量吸入性糖皮质激素、长效β2肾上腺素能受体激动剂联合白三烯受体拮抗剂以及抗组胺治疗后,哮喘症状仍持续不缓解;放射性变应原吸附试验显示患者对环境中多种真菌物质致敏,决定予以增加伊曲康唑治疗(100 mg/次,2次/天),连续6个月,期间患者血清IgE水平明显降低,肺功能FEV1/FVC、FEV1%预计值等平均水平趋于正常;但停用伊曲康唑3个月后,该患者再一次因哮喘加重而入院。过去研究也证实,外源性烟曲霉暴露或低剂量烟曲霉气道定植足以诱发过敏性炎症反应,加重哮喘症状,这类特殊的重症哮喘亚型被定义为真菌致敏性重症哮喘(severe asthma associated with fungal sensitization, SAFS)[10]。Denning[11]等人给予SAFS患者连续32周口服伊曲康唑治疗(200 mg/次,2次/天),随访16周后发现患者生活量表评分明显增高,肺功能显著改善。同样的,在临床工作中,我们也给予部分难治性哮喘患者(根据国际公认制定的规范化治疗GINA指南[12]诊治,哮喘症状仍控制不佳或反复发作的患者)尝试性抗真菌治疗,发现其对控制哮喘症状及改善肺功能均有疗效。因此,我们推测,烟曲霉相关的重症哮喘或难治性哮喘可能与烟曲霉引起的药物敏感性降低有关。
Boardman[13]等人概括了一些可能影响糖皮质激素敏感性的因素,包括糖皮质激素在局部组织中的浓度、糖皮质激素受体的数量、与糖皮质激素受体的结合力以及糖皮质激素信号通路的调控等。其中,糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor, GCR)数量的减少改变了糖皮质激素与GCR的结合力,从而影响糖皮质激素的敏感性[14, 15]。GCR是核受体超家族的一员,是皮质醇和其他糖皮质激素的结合位点[16]。当配体不存在或不处于活性状态时,GCR只是作为蛋白复合体的一部分而分布在细胞质中。一旦与配体结合,GCR便从蛋白复合体中解离出来,迅速定位于细胞核上,激活GCR二聚体并与糖皮质激素反应原件结合,从而启动抗炎作用或抑制促炎性作用[17, 18]。既往有研究结果显示儿童外周血单核细胞中GCR的低表达可能导致糖皮质抵抗型肾病综合征[19]。糖皮质激素抵抗型儿童患者,其T淋巴细胞内GCR表达水平显著低于糖皮质激素敏感型儿童[17]。在系统性红斑狼疮的患者中发现,组织中GCR表达的降低及其与地塞米松结合力的降低是导致激素抵抗反应的主要原因[18]。值得注意的是,在感染性疾病中,无论是病毒性还是细菌性感染,均发现其GCR的表达和功能以及GCR结合容量显著降低。王水琴[20]等人用人工感染鸡马立克氏病毒的方法发现受马立克氏病毒攻击后,鸡外周血淋巴细胞GCR含量及T淋巴细胞对植物凝集素刺激的增殖率均明显降低。Dener[21]等人发现I型疱疹病毒可下调大鼠海马组织中GCR的表达进而诱导糖皮质激素抵抗。甲型病毒性肝炎患者和病毒性心肌炎患者其外周血淋巴细胞或外周血白细胞内的GCR含量也较正常人群明显降低[22, 23]。此外,在金黄色葡萄球菌败血症小鼠血细胞内也发现GCR的表达以及地塞米松的核转移能力显著下调,地塞米松的作用受到抑制[24]。由此,我们推测烟曲霉可能也会影响GCR的表达,导致暴露于烟曲霉中的哮喘患者对糖皮质激素不敏感。
β2肾上腺素能受体激动剂敏感性受多种临床因素以及β2肾上腺素能受体(β2-adrenergic receptor,ADRB2)基因多态性的影响。ADRB2是一种G蛋白偶联受体,在β2肾上腺素能受体激动剂的刺激下,调控血管扩张和支气管舒张等一系列生理效应[25]。Moore等人发现呼吸道合胞病毒感染可以减少ADRB2的数量,导致气道平滑肌对β2肾上腺素能受体激动剂的敏感性降低[26]。呼吸道合胞病毒感染还可豚鼠肺组织β受体亲和力下降,而低亲和力M受体含量增加、亲和力提高,通过该两种受体的失平衡介导气道高反应性[27]。在慢性阻塞性肺疾病患者中,其外周血单个核细胞和诱导痰细胞ADRB2表达均下降,并随着病情加重而呈逐渐降低的趋势,且诱导痰细胞ADRB2表达的变化更为显著,提示呼吸道炎症细胞ADRB2的表达对提示慢性阻塞性肺疾病病情进展具有重要指导意义[28]。经盲肠结扎穿孔术所致混合性细菌感染而建立的脓毒症大鼠模型中,发现其心肌ADRB1 mRNA表达较正常大鼠明显下降,ADRB3 mRNA表达明显高于正常大鼠,而ADRB2 mRNA在两组间无显著性差异,提示脓毒症大鼠心肌ADRB的表达确实存在明显的改变[29]。基于上述研究显示的病毒性感染和细菌性感染对ADRB表达量具有调节作用,我们推测烟曲霉是否对ADRB表达也存在一定影响?
本研究第一部分实验正是基于上述研究结果,提出烟曲霉导致的GCR和ADRB2表达的改变可能是导致难治性哮喘的重要原因之一。通过建立哮喘大鼠模型,给予烟曲霉孢子吸入,我们对GCR和ADRB2在哮喘肺内的表达变化进行研究,探讨烟曲霉在难治性哮喘中的意义。
在慢性气道炎症状态下,气道微环境的改变可能适合烟曲霉在气道内粘附和定植,而烟曲霉在肺内的长时间滞留,反过来又是气道炎症慢性化的主要原因。气道黏液由水、碳水化合物、电解质、糖蛋白及有抗微生物活性的小分子蛋白等物质组成。最适合黏液纤毛系统发挥作用的微环境为:温度36~40℃、pH6.5~7.5。高度糖基化的高分子量黏蛋白(MUC)是气道黏液的最主要成分,黏液的粘稠度和弹性(即MUC含量)能影响纤毛的运动[30]。我们先前的研究结果发现慢性烟曲霉暴露可上调哮喘大鼠气道黏蛋白MUC5AC表达,这种改变又有利于烟曲霉的粘附与定植[6]。气道微环境还包括分泌的炎症因子,Th2细胞过度活化所产生的Th2型细胞因子在哮喘慢性气道炎症中起重要作用,我们早期的研究也显示烟曲霉暴露的哮喘大鼠肺泡灌洗液中IL-5、IL-13高表达[5],而IL-33作为前炎症因子,与其配体ST2结合后,可刺激气道内II型固有淋巴细胞(group2innatelymphoidcells,ILC2s)分泌大量的Th2型细胞因子IL-5和IL-13[31, 32]。目前,对哮喘、真菌定植与气道微环境的关系研究较少。由于呼吸道感染可诱发或加重哮喘,哮喘又可继发呼吸道感染,在临床上,除了给予哮喘患者糖皮质激素治疗以外,常把抗生素静脉滴注常作为必备药物来用,药物使用对气道微环境是否影响目前也不明确。因此,本研究第二部分实验主要观察激素、抗生素干预哮喘大鼠对气道微环境的影响以及对气道和肺组织内烟曲霉孢子清除、定植情况的观察。
综上所述,我们推测烟曲霉可能一方面通过调节气道内GCR和ADRB2的表达,降低糖皮质激素和β2肾上腺素能受体激动剂的药物反应性,一方面参与气道炎性细胞的募集、炎症因子的分泌以及气道高反应的形成,进而导致重症哮喘或难治性哮喘的发生;此外,哮喘状态、烟曲霉粘附与定植以及长期激素、抗生素使用与气道微环境变化之间可能存在密切联系。为此,在本项目中,我们用卵清白蛋白致敏并激发复制了哮喘大鼠模型,然后经鼻给予烟曲霉孢子吸入,观察烟曲霉孢子吸入后哮喘大鼠气道炎症、气道高反应性、以及肺组织内GCR和ADRB2表达的变化,同时观察哮喘状态、烟曲霉孢子吸入、长期地塞米松和/或头孢曲松钠干预对气道微环境(包括pH、电解质、总蛋白、乳酸脱氢酶、酸性磷酸酶以及IL-33)的影响,从而探讨烟曲霉所致重症哮喘或难治性哮喘的作用机制和可能的干预措施。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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第一章
烟曲霉孢子暴露对支气管哮喘大鼠肺组织糖皮质激素受体和β2肾上腺素能受体表达的影响
吸入性糖皮质激素因其良好的抗炎作用被认为是治疗哮喘的首选方案,β2肾上腺素能受体激动剂具有较好的支气管舒张作用,是控制哮喘症状的主要药物之一。但部分哮喘患者对吸入性糖皮质激素和β2肾上腺素能受体激动剂治疗的效果并不满意,即使根据规范化GINA指南诊治,哮喘症状仍控制不佳或反复发作,但联合抗真菌药物伊曲康唑尝试性治疗后,哮喘症状及肺功能较前明显改善[1, 2]。研究发现急性加重的哮喘患者所居住的室内环境中常有高浓度的烟曲霉孢子存在,且烟曲霉在气道内的定植与肺功能的恶化有着紧密联系。但烟曲霉加重哮喘或引起难治性哮喘的相关机制目前尚不明确。研究表明,糖皮质激素受体Glucocorticoid receptor, GCR)和β2肾上腺素能受体(β2-adrenergic receptor,ADRB2)数量的减少可以影响糖皮质激素和β2肾上腺素能受体激动剂的治疗效果[3-5],而既往研究均有显示病毒性感染和细菌性感染可调节GCR和ADRB2的表达量[5-9],因此,我们推测真菌孢子吸入也可能引起GCR和ADRB2表达量的变化。本研究采用卵清白蛋白致敏、激发复制哮喘模型并给予烟曲霉孢子吸入,观察烟曲霉孢子对哮喘大鼠气道炎症、气道反应性以及肺组织内GCR和ADRB2表达水平的影响,旨在探讨烟曲霉影响糖皮质激素和β2肾上腺素能受体激动剂敏感性、导致难治性哮喘的可能机制。
 
材料与方法
一、 试剂材料与仪器
(一) 实验动物
SPF级Wistar大鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司,生产许可证号:SCXK(沪)2012-0002,雄性,体重180~200g,实验前于复旦大学医学院动物房适应性饲养一周,恒温环境(23 ℃),相对湿度(40%),12小时昼夜,自由进食和取水,并观察生长情况。动物饲养及实验方案均严格按照复旦大学动物伦理委员会动物实验规范执行(证书DF478)。
 
(二) 烟曲霉菌株
AF293烟曲霉标准株为复旦大学附属华山医院真菌室保存菌株。由肺曲霉菌病患者临床痰液标本中分离,经鉴定后保存。
 
(三) 试剂与材料
卵白蛋白(Grade V) 美国Sigma公司
氢氧化铝 美国Sigma公司
生理盐水 上海华源制药股份有限公司
乙酰甲胆碱 美国Sigma公司
GCR兔抗鼠单克隆抗体 英国abcam公司
ADRB2兔抗鼠单克隆抗体 英国abcam公司
大鼠IgE ELISA试剂盒 英国abcam公司
马铃薯葡萄糖琼脂培养基 上海盛思公司
易氟烷 美国百特公司
戊巴比妥钠 德国默克公司
PBS 吉诺生物医药技术有限公司
PCR相关试剂
Trizol 美国Invitrogen公司
氯仿 国药集团化学试剂有限公司
异丙醇 国药集团化学试剂有限公司
75%乙醇 国药集团化学试剂有限公司
DEPC(焦磷酸二乙酯) 江苏碧云天生物技术有限公司
Realtime PCR用cDNA合成的预混型逆转录试剂盒 日本TOYOBO公司
SYBR Green PCR试剂盒 日本TOYOBO公司
引物设计及合成 生工生物工程(上海)有限公司
Western相关试剂
BCA蛋白测定试剂盒 江苏碧云天生物技术有限公司
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 江苏碧云天生物技术有限公司
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒
SDS-PAGE电泳液 江苏碧云天生物技术有限公司
江苏碧云天生物技术有限公司
BeyoECL Plus 江苏碧云天生物技术有限公司
Western转膜液、封闭液 江苏碧云天生物技术有限公司
Western一抗、二抗稀释液 江苏碧云天生物技术有限公司
彩色预染蛋白质分子量标准 江苏碧云天生物技术有限公司
20XTBS Buffer缓冲液 生工生物工程(上海)有限公司
GAPDH抗体 江苏碧云天生物技术有限公司
辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 江苏碧云天生物技术有限公司
中性甲醛、梯度酒精、10%盐酸乙醇、苏木素、0.5%伊红溶液等均由复旦大学附属中山医院实验平台提供配制。
 
(四)仪器设备
手术器械 上海医用设备厂
气管插管套管针 日本TERUMO公司
负压真空采血管 美国BD公司
压缩式雾化器(AG CLASSIC) 飞利浦公司
无创式动物肺功能检测分析仪(WBP) 美国Buxco公司
五分类血液细胞分析仪(SA-3B100123) 深圳迈瑞生物公司
组织匀浆机(Tissuelyser-24) 上海净信公司
血气、电解质生化分析仪(cobas b 221) 罗氏诊断产品(上海)有限公司
Real-time PCR分析仪(7900HT) 美国ABI公司
Western电泳仪 美国Bio-Rad公司
化学发光凝胶成像系统 美国Cell Biosciences公司
精细天平 瑞士METTLER TOLEDO公司
高速低温离心机 美国Eppendorf公司
普通光学显微镜 日本Olympus公司
酶标仪 美国BioTek公司
电热恒温干燥箱 美国Bio-Rad公司
血球计数板 上海求精生化试剂仪器有限公司
微量移液器 法国Gilson公司
冻存管 美国Corning公司
离心管 美国Corning公司
不同型号吸头 美国Axygen公司
不同型号Eppendorf管 美国Axygen公司
96孔板 美国FALCON
-80℃冰箱 中国海尔公司
4℃和-20℃冰箱 BOSCH公司
生物安全柜 Heal Force
制冰机 美国Scotsman公司
 
(五)主要溶液的配制
1. OVA腹腔致敏液:1 mg OVA+100 mg氢氧化铝粉剂溶于1 mL无菌生理盐水中,现配现用。
2. 1% OVA雾化液:50 mg OVA溶于5 mL无菌生理盐水中,现配现用。
3. 0.1%吐温80:吐温80 1mL+0.9%生理盐水 1000 mL配制而得。
 
二、 实验方法和步骤
(一)实验动物分组
    32只雄性Wistar大鼠随机分为4组,每组8只。1)空白对照组:采用无菌生理盐水致敏并激发,并吸入生理盐水;2)单纯孢子组:采用无菌生理盐水致敏并激发,并吸入烟曲霉孢子;3)单纯哮喘组:采用鸡卵清白蛋白(OVA)致敏并激发的方法建立慢性哮喘模型,并吸入生理盐水;4)哮喘+孢子组:慢性哮喘大鼠,并吸入烟曲霉孢子。各组大鼠于末次经鼻吸入后24 h检测气道反应性(见表1)。
表1:动物分组及处理
组别 组名 腹腔注射致敏
(第1、8天) 雾化激发
(第15~56天) 滴鼻
(第57~59天)
空白对照组 CON 生理盐水 生理盐水 生理盐水
单纯孢子组 CON+AF 生理盐水 生理盐水 烟曲霉孢子
单纯哮喘组 OVA OVA致敏液 1% OVA 生理盐水
哮喘+孢子组 OVA+AF OVA致敏液 1% OVA 烟曲霉孢子
 
(二)哮喘模型的建立
健康雄性Wistar大鼠,于实验第1、8天给予OVA悬液腹腔注射致敏(1 mL/只,1 mg OVA+100 mg氢氧化铝溶于1 mL无菌生理盐水中,现配现用);第15天起,将大鼠置于透明密闭雾化箱(20cm × 40cm × 50cm)中给予连续6周的1% OVA悬液雾化吸入以激发哮喘(每周5次,每次30min)。
 
(三)烟曲霉孢子悬液制备
取烟曲霉菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上,37℃培养7天。用新鲜配制的无菌0.1%吐温80生理盐水溶液10mL反复冲洗培养基表面收集分生孢子悬液,通过8层无菌纱布过滤去除菌丝。在显微镜下用血球计数板计数孢子数量,再将孢子悬液3000rpm/min离心15分钟,弃上清,孢子重悬于无菌生理盐水,并调整孢子浓度为1.0 × 107孢子/mL。操作过程中严格无菌操作。活菌在平板上10倍系列稀释,定量培养以检测孢子活性。
 
 
 
 
 
 
 
图1:烟曲霉菌落肉眼(A)和镜下观察(B)
Figure 1:Photograph of Aspergillus fumigates (A) and condia under microscope(B)
 
(四)烟曲霉菌吸入:滴鼻法
大鼠于异氟烷麻醉后垂直位放置,用移液枪吸取200μL烟曲霉孢子悬液缓慢滴入双侧鼻腔,每侧鼻孔滴入100 μL,连续3天。此方法参考Marra[10-13]等人侵袭性肺曲霉菌病模型的建立,文献证实该方法足以使孢子达到肺部,在肺泡内聚集甚至出现菌丝生长。
 
(五)气道反应性测定
用体积描记法测定增强呼气间歇(enhance pause, Penh)的原理如图2所示:曲线反映的是体描箱内大鼠呼气时的压力变化;曲线上、下部分表示呼气相和吸气相;气流受限时,曲线的呼气相部分显著延长,表现为阻塞性通气功能障碍时特有的呼气末凹陷,呼气相延长的程度反映了气流受限的程度,定义为呼气间歇(Pause),用吸气峰流速(peak inspiration pressure,PIP)及呼气峰流速(peak expiration pressure,PEP)的比值将其标准化即为Penh值,该参数即可反映气道反应性。计算公式如图所示:其中Te、Ti分别代表呼气相时间和吸气相时间,Tr代表呼气相“松弛时间”即呼气相描记箱内压力衰减为PEP的36%所用时间。Penh=PEP/PIP×Pause。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图 2:增强呼气间歇
Figure 2: Penh
 
第60天(末次生理盐水或烟曲霉菌孢子滴鼻后24 h)将自然状态下的Wistar大鼠置入密闭体积描记器中,用不同浓度(3.125,6.25,12.5,25和50 g/L)
的乙酰甲胆碱溶液激发支气管哮喘,以PBS作为基线,记录不同浓度乙酰甲胆碱激发下其气道阻力参数Penh值的变化。每次雾化前先让大鼠在体积描记器内适应5 min,雾化2 min,记录3 min,恢复时间 5 min。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(六)手术和取材
各组大鼠于末次滴鼻72 h后,予2%戊巴比妥钠麻醉,固定于动物手术台
 
酒精消毒颈部、胸腹部皮肤
 
迅速剖开腹腔,暴露腹主动脉,用真空负压采血管(EDTA抗凝管和促凝管)分别取血;取全血2 mL立即行pH值和电解质检测;剩余抗凝管内全血予3000 rpm/min,4 ℃,离心15 min,取上清保存于-80 ℃待用;促凝管于4 ℃冰箱静置24 h待血清析出,3000 rpm/min,4 ℃,离心15 min,取上清保存于
-80 ℃待用,用于血清IgE检测
 
剪开颈部皮肤,暴露气管,作一T型切口,插入气管插管套管针,丝线固定,剖开胸腔,靠近右肺门处结扎右主支气管
 
取右肺上叶置于中性甲醛中固定72 h,脱水、石蜡包埋,5 μm厚切片,进行苏木素-伊红(hematoxylin and eosin, HE)、过碘酸乌洛托品银染色(Periodic Acid-Silver Methenamine, PASM)染色
 
右肺中下叶分别放入已高压消毒的冻存管,于-80 ℃保存待用
 
经气管插管分3次注入无菌PBS进行左肺支气管肺泡灌洗,共10 mL,回收的肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)于1000 rpm/min,4℃,离心10 min,取上清于-80℃保存,细胞沉淀用于细胞分类计数
 
(七)BALF白细胞总数和细胞分类计数
细胞沉淀用200μL PBS重悬后,使用全自动五分类血液细胞分析仪进行白细胞总数和细胞分类计数。剩余的BALF取100 μL用于烟曲霉培养。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(八)血清中IgE测定:ELISA法
按IgE检测试剂盒说明书进行,具体操作如下:
准备工作:
1. 1×稀释液(Diluent Solution):浓缩稀释液(5×)用双蒸水稀释成1×:即1份浓缩稀释液加入4份双蒸水。
2. 1×洗涤液(Wash Buffer):浓缩洗涤液(20×)用双蒸水稀释成1×:即1份浓缩洗涤液加入19份双蒸水。
3. 1×酶标抗体(Enzyme-Antibody Conjugate):10μL酶标抗体加入990 μL 1×稀释液。
4. 配制标准品(Standard):标准品初始浓度为32 ng/mL。
配制16 ng/mL → 1 ng/mL标准品:准备5只Eppendorf管,每管加300 μL稀释液,分别标记上16ng/mL,8 ng/mL,4ng/mL,2 ng/mL,1 ng/mL。取300 μL 32 ng/mL的标准品加入标记16 ng/mL的管中,混匀后同样取出300 μL,加入下一只管中,余同此类推,直到最后一只样品管。
5.试剂盒应平衡至室温再试验。
操作步骤:
将标准品各100 μL依次加入一排6孔中,1孔只加稀释液的作为零孔
 
加样:待测品每孔各加入待测样品100 μL
 
酶标板加封板膜,室温反应60 min
 
洗板:甩去酶标板内液体,再对着滤纸拍几下,用洗涤液将反应板充分洗涤4次,在滤纸上拍干
 
按每孔100 μL依次加入酶标抗体,酶标板加封板膜,室温避光反应60 min
 
洗板:方法同上
 
按每孔100 μL依次加入TMB显色液,室温避光反应10 min
 
按每孔100 μL依次加入TMB终止液,此时蓝色立转黄色
 
用酶标仪在450 nm测定吸光值(OD值)
结果计算:
1. 所有标准品和样品的OD值都应减去零孔的OD值后再进行计算。
2. 以标准品浓度32、16、8、4、2、1 ng/mL作为纵坐标,对应OD值作为横坐标,坐标纸上画出标准曲线。
3. 根据样品OD值在该曲线上查出相应IgE含量。
 
(九)肺组织病理检查
右肺上叶置于4%多聚甲醛中固定48 h,脱水、石蜡包埋,5 μm厚切片,进行苏木素-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色。具体方法如下:
肺组织石蜡5 μm厚连续切片,60 ℃烘箱烤约1 h
 
二甲苯10 min
 
无水乙醇2 min
 
95%乙醇2 min
 
85%乙醇3 min
 
75%乙醇3 min
 
蒸馏水洗2 min
 
苏木素液5 min
 
水洗去除多余染料1~3 s
 
10%盐酸乙醇分化30 s
 
流水洗15~30 min 返蓝
 
蒸馏水洗5 s
 
0.5%伊红溶液1~5 min
 
75%乙醇3 min
 
85%乙醇2 min
 
95%乙醇1 min
 
无水乙醇1 min
 
重复无水乙醇2 min
 
二甲苯5 min
 
重复二甲苯5 min
 
自然干燥后中性树胶封片
结果:胞浆呈淡红色,胞核呈蓝黑色。
 
(十)大鼠肺组织GCR和ADRB2 mRNA检测
1. 大鼠肺组织RNA提取:Trizol法
具体步骤:
100 mg 大鼠肺组织放入1.5 mL 无酶Eppendorf管中,加500 μL Trizol,放入研磨小钢珠,将Eppendorf管放入预冷的组织匀浆机中,60 Hz,60 s
 
取出装有匀浆液的Eppendorf管,室温静置5 min,加入100 μL氯仿,用力震荡Eppendorf管15 s充分混匀,接着4 ℃,12000 rpm/min离心15 min
混悬液分三层:上层为RNA水相,中间薄层为DNA,下层为蛋白有机相层,有组织块沉淀。
 
将上清(内含RNA)转移至新的无酶Eppendorf管,加入250 μL异丙醇,轻轻混匀,室温静置10 min,4 ℃,12000 rpm/min离心10 min,RNA沉淀至管底
 
用移液枪吸弃上清,底部少量沉淀为RNA,空气干燥管壁,加入500 μL 75%乙醇洗涤RNA,轻轻震荡几次后4 ℃,12000 rpm/min离心5 min,吸弃上清
 
将移液枪将Eppendorf管内壁吸干,室温放置至管壁恰好干燥,加入适量DEPC水(20~50 μL,根据沉淀多少而定),移液枪轻轻吹打溶解
2. RNA纯度和浓度测定
具体步骤:
测定前用1 μL双氧水冲洗加样孔,吸纸擦净
 
移液枪于加样孔加入1 μLDEPC水,设为空白对照
 
移液枪吸取1 μL提取的RNA加入加样孔中,紫外线分光光度仪上分别读取在260 nm和280 nm波长处的吸光度A值
 
纯度测定:A260nm/A280nm比值于1.8~2.0之间,说明所提取的RNA未被降解,纯度高,可用于后续实验
 
浓度测定:根据260 nm下的吸光度,获得RNA浓度即可
3. 逆转录合成cDNA
采用TOYOBO公司的逆转录试剂盒,试验步骤如下:
总反应体系为20 μL,200 μL无酶Eppendorf管中依次加入:
Nuclease-free Water:20-样本量-Master Mix量
5×Master Mix:4 μL;
RNA样本:2000/RNA浓度μL;
 
轻轻混匀,离心至管底
 
PCR仪中逆转录即得总cDNA,-20 ℃冰箱保存备用
4. 实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)
(1):GCR、ADRB2序列由Genebank获得,引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成,引物序列如下:
β-actin片段大小150 bp
上游:5′- GCAGGAGTACGATGAGTCCG -3′
下游:5′- ACGCAGCTCAGTAACAGTCC -3′
GCR片段大小104 bp
上游:5′- GGTGATTGAACCCGAGGTGT -3′
下游:5′- TCACTTGACGCCCACCTAAC -3′
ADRB2片段大小118 bp
上游:5′- AAGAATAAGGCCCGAGTGGT -3′
下游:5′- CATAACAGTCGATGGCTTGC -3′
(2)反应过程:
采用TOYOBO公司的SYBR Green PCR试剂盒:10 μL反应体系
目的基因引物 各0.4 μL
SYBRGreen Mix 5 μL
Plus 1 μL
ddH2O 2.2 μL
cDNA 1 μL
震荡混匀短暂离心后放入PCR仪,设置循环参数为:95 ℃预变性15 s;95 ℃变性15 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸45 s,共40个循环;95 ℃15 s,60 ℃ 60 s,使产物稳定。所得产物于-20 ℃保存。
5. 结果分析
实验数据采用仪器自带分析软件,根据所测CT值,通过2‐ΔΔCT计算各组GCR和ADRB2 mRNA的相对含量。
 
(十一)大鼠肺组织GCR和ADRB2蛋白质检测
1. 大鼠肺组织蛋白质提取
具体步骤:
取100 mg肺组织,PBS缓冲液充分洗涤,预先将预冷的加有蛋白酶抑制的蛋白质裂解液(100 μL)加入Eppendorf管中
 
将组织块放入Eppendorf管中,放入研磨小钢珠,将Eppendorf管放入预冷的组织匀浆机中,60 Hz,60 s,充分匀浆
 
4℃,12000 rpm/min离心10 min
 
弃去沉淀,将上清液转移至新的Eppendorf管中,进一步检测蛋白浓度
2. 蛋白定量,按BCA蛋白测定试剂盒说明书进行,步骤如下:
BCA工作液的配制:根据样品数量(每孔200 μL),将solution A和solution B以50:1的体积混匀配制成BCA工作液,室温24 h内稳定
 
蛋白标准品BSA的准备:取0.8 mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准(20 mg BSA)中,充分溶解后配制成25 mg/mL 的蛋白标准溶液,-20 ℃保存;取适量25 mg/mL 蛋白标准溶液用PBS稀释至终浓度为0.5 mg/mL的工作液(BSA工作液)待用
 
将BSA工作液按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔,加PBS补足到20 μL
 
将1 μL待测样本+19 μL PBS加入96孔板中
 
每孔各加入200 μL BCA工作液,轻轻用加样枪混匀,用锡纸包裹避光,37 ℃温箱孵育30 min
 
用酶标仪测定波长A562的吸光度
 
根据标准曲线和使用样品体积及稀释倍数计算出BALF和血浆的蛋白浓度
3. 蛋白上样和电泳:步骤如下
清洁液擦洗干净制胶玻璃板,擦洗过后分别用自来水和蒸馏水冲洗干净,竖立晾干
 
玻璃板对齐后放入夹中夹紧,垂直卡在架子上准备灌胶(操作时将两玻璃对齐,并与架子底部的海绵垫卡紧,以免漏胶)
 
根据说明书配制10%分离胶,用移液枪吸取灌胶,使胶沿着玻璃板缓慢流下,避免产生气泡,待胶面升至标记处即可;分离胶灌完后用水封住,隔离空气使其表面平整。
 
待胶与水之间出现明显分离线时,说明胶已凝固;倒去上层水,滤纸吸干
 
根据说明书配制4%浓缩胶,使用移液枪灌胶;灌满浓缩胶后立即插入上样梳子;待浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出
 
将浓缩胶放入电泳槽,小玻璃板面向内,大玻璃板面向外(若只跑一块胶,则电泳槽的另一边需垫一块塑料板,且有字的一面面向外)
 
电泳液粉剂用1 L蒸馏水溶解后倒入电泳槽,电泳液至少要漫过内侧的玻璃板
 
用移液枪细枪头插至加样孔底缓慢加入样品(20 μL,含50 μg蛋白),若加样过快可使样品冲出加样孔
 
电泳:电泳时在浓缩胶时使用90 V低电压电泳,大约30 min溴酚蓝进入分离胶时,改用120 V高电压电泳,大约1 h溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳
4. 转膜:步骤如下
转膜液粉剂用1 L蒸馏水溶解待用
 
准备好Bio-Rad蛋白转移装置夹板,用转膜液稍微冲洗,滤纸和海绵用转膜液浸湿
 
剪一块与胶相同大小的PVDF膜,浸入100%甲醛溶液:10 s取出;转移至转膜液中平衡10 min
 
转移装置顺序如下:电源正极-海绵-3层滤纸-PVDF膜-凝胶-3层滤纸-海绵-电源负极
 
放入装有转膜液的转膜槽中,并将转膜槽放入装有碎冰的冰盒内,最大程度降低转膜时产生过多热量而影响蛋白的转膜
 
三明治法恒压电转移至PVDF膜,250 mA,60 min
 
转膜结束,取出PVDF膜,观察预染蛋白Marker的转膜情况;将膜放入TBST轻轻漂洗,洗膜3次,每次5 min;洗膜后将膜放入封闭液中室温下封闭1 h
5. 免疫反应
应用1:1000稀释的I抗孵育,4 ℃摇床过夜
 
TBST洗膜3次,每次5 min;加入辣根过氧化物酶标记的II抗,室温孵育1 h
 
ECL发光显色:将ECL发光试剂盒的A液和B液等体积混合,滴到PVDF膜上,暗室内压片曝光15 s-1 min,显影1 min,定影 1min后,扫描仪扫描胶片,软件分析条带灰度值
 
采用AlphaVIEW SA凝胶图像分析软件,先计算目标蛋白/看家蛋白的比值,再进行蛋白质表达水平的相对定量的分析
 
结果
一、各组大鼠气道反应性的比较
各组大鼠组内Penh值随着乙酰甲胆碱浓度梯度升高而呈上升趋势。组间比较结果显示:单纯哮喘组(OVA组)大鼠的Penh值在不同浓度乙酰甲胆碱溶液激发时均明显高于空白对照组(CON组),表明哮喘模型建造成功。空白对照组吸入烟曲霉孢子后(CON+AF组)的Penh值在不同浓度乙酰甲胆碱溶液激发时略高于空白对照组(CON组),差异没有统计学意义。而哮喘+孢子组(OVA+AF组),其Penh值在乙酰甲胆碱浓度为25 mg/ml和50 mg/ml激发时显著高于单纯哮喘组(OVA组),差异具有统计学意义(OVA+AF 组:700.51±34.09vsOVA组:608.24±48.48, P<0.01;OVA+AF 组:826.61±56.70vsOVA组:654.53±46.07,P<0.01。见图5),表明有哮喘基础的情况下暴露于烟曲霉孢子更易诱发气道高反应性。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图5:各组大鼠气道反应性测定(与CON组比较,**P< 0.01;与OVA组比较,++P < 0.01)
Figure 5: Measurement of airway hyper-responsiveness(**P< 0.01 versus CON groups; ++P< 0.01 versus OVA groups)
 
二、各组大鼠BALF中嗜酸性粒细胞比例
由图6A可见,单纯哮喘组大鼠(OVA组)BALF中的嗜酸性粒细胞比例比空白对照组(CON组)显著升高(OVA组:13.55±2.10% vsCON组:6.27±2.91%,P<0.01),提示哮喘模型建造成功。单纯孢子组(CON+AF组)BALF中嗜酸性粒细胞百分比与空白对照组(CON组)比较无显著差异(CON+AF组:10.83±3.20vs CON组:6.27±2.91,P>0.05)。单纯哮喘组吸入烟曲霉孢子后(OVA+AF组),其BALF中的嗜酸性粒细胞比例较单纯哮喘组(OVA组)有轻微升高,但差异不具有统计学意义(OVA+AF组:16.08±3.37% vsOVA组:13.55±2.10%,P>0.05)。
 
三、各组大鼠血清IgE水平
由图6B可见,单纯哮喘组大鼠(OVA组)血清中的IgE水平比空白对照组(CON组)显著升高(OVA组:8.63±1.60vsCON组:5.37±0.68,P<0.01),提示哮喘模型建造成功。单纯孢子组(CON+AF组)血清中IgE含量与空白对照组(CON组)比较无显著差异(CON+AF组:6.26±0.94vs CON组:5.37±0.68,P>0.05)。单纯哮喘组吸入烟曲霉孢子后(OVA+AF组),其血清中IgE的水平较单纯哮喘组(OVA组)有轻微升高,但差异不具有统计学意义(OVA+AF组:10.11±2.58vsOVA组:8.63±1.60,P>0.05)。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图6:各组大鼠BALF中嗜酸性粒细胞比例(A)和血清中IgE水平(B)
(与CON组比较,**P< 0.01)
Figure 6:The percentage of eosinophil in BAL fluid(A)and the level of IgE in serum(B)(**P< 0.01 versus CON groups)
 
四、各组大鼠的气道炎症浸润和病理学观察
由图7可见,空白对照组(CON组)和单纯孢子组(CON+AF组)肺泡结构完整,未见明显气道炎症浸润及气道上皮损伤脱落;单纯哮喘组(OVA组)可见气管和肺血管周围明显的炎症细胞浸润,肺泡间隔增厚、结构破坏,平滑肌层增厚;哮喘+孢子组(OVA+AF组)气道炎症和重塑性改变较单纯哮喘组(OVA组)略为严重。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图7:肺组织HE染色观察各组大鼠气道炎症浸润和病理学改变。(A) 空白对照组;(B) 单纯孢子组;(C) 单纯哮喘组;(D) 哮喘+孢子组
Figure 7:Pathological observation of airway inflammatory infiltration using Hematoxylin-eosin (HE) staining of lung tissue. (A) CON groups; (B)CON+AF groups; (C) OVA groups; (D) OVA+AF groups. Original magnification, ×100 (left) and ×200 (right)
五、各组大鼠肺组织GCR mRNA和ADRB2 mRNA的相对表达
肺组织GCR mRNA的相对表达,RT-PCR检测显示:与空白对照组比较(CON组)相比,单纯孢子组(CON+AF组)大鼠的肺组织GCR mRNA水平显著降低(CON+AF组:0.65±0.10vsCON组:0.93±0.15,P<0.01);同样的,与单纯哮喘组(OVA组)比较,哮喘+孢子组(OVA+AF组)的肺组织GCR mRNA水平也显著降低(OVA+AF组:0.52±0.08vsOVA组:0.72±0.22,P<0.05)。然而,RT-PCR检测显示各组大鼠肺组织ADRB2 mRNA的相对表达量无显著差异(分别为0.73±0.22,0.57±0.19,0.62±0.28,0.67±0.38,P>0.05)。见图8。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图8:肺组织GCR mRNA和ADRB2 mRNA的相对表达。(A)各组大鼠肺组织GCR mRNA的RT-PCR检测;(B)各组大鼠肺组织ADRB2 mRNA的RT-PCR检测。(与CON组比较,**P< 0.01;与OVA组比较,+P< 0.05)
Figure 8:Expression of GCR and ADRB2 mRNA in the lung.(A)RT-PCR analysis for GCR mRNA;(B)RT-PCR analysis for ADRB2 mRNA.(**P< 0.01 versus CON groups;+P< 0.05versus OVA groups)
 
六、各组大鼠肺组织GCR蛋白和ADRB2蛋白的相对表达
各组大鼠肺组织GCR和ADRB2的表达用免疫印迹法(Western blot)进一步验证。Western blot法与RT-PCR法所测结果相一致。Western blot结果显示:与空白对照组比较(CON组)相比,单纯孢子组(CON+AF组)大鼠的肺组织鼠的肺组织显著降低(CON+AF组:89.05±8.57vsCON组:100±0.00,P<0.01);同样的,与单纯哮喘组(OVA组)比较,哮喘+孢子组(OVA+AF组)的肺组织GCR蛋白表达水平也显著降低(OVA+AF组:59.09±7.60vsOVA组:81.88±15.41,P<0.05)。此外,Western blot法检测示各组大鼠肺组织ADRB2蛋白的相对表达量无显著差异(分别为1.00±0.00,0.98±0.14,1.04±0.17,0.91±0.18,P>0.05)。见图9。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图9:肺组织GCR蛋白和ADRB2蛋白的相对表达。(A)各组大鼠肺组织GCR 蛋白的Western blot检测;(B)各组大鼠肺组织ADRB2蛋白的Western blot检测。(与CON组比较,**P< 0.01;与OVA组比较,+P< 0.05)
Figure 9:Expression of GCR and ADRB2 protein in the lung.(A)Western blot analysis for GCR protein;(B)Western blot analysis for ADRB2 protein.(**P< 0.01 versus CON groups;+P< 0.05versus OVA groups)
 
讨论
烟曲霉既是一种重要的条件致病菌,又是一种重要的外源性过敏原,广泛分布于室外及室内环境中,由于其孢子结构微小,直径仅有2~3μm,使之吸入易于到达宿主肺泡,通过菌丝生长而定植于气道内或引发侵袭性感染。(Fungi and allergic lower respiratory tract diseases)。气道内烟曲霉定植或者机体对烟曲霉过敏是哮喘加重和进展的主要危险因素之一,其产生的酶类和毒素在过敏反应中起辅助作用。研究发现急性加重的哮喘患者所居住的室内环境中常有高浓度的烟曲霉孢子存在,并且烟曲霉在气道内的定植与肺功能的恶化有着密切联系[14, 15]。本实验采用卵清白蛋白致敏、激发的方法构建哮喘模型,在此基础上研究烟曲霉孢子吸入对哮喘大鼠气道炎症和气道高反应性的影响。该实验方法与直接用烟曲霉抗原致敏、激发复制哮喘模型不同,更加接近于研究哮喘患者在日常生活中接触烟曲霉孢子后的哮喘急性发作或加重的实际情况。
本实验结果表明,哮喘大鼠吸入烟曲霉孢子后,气道反应性Penh值进一步升高,在乙酰甲胆碱浓度为25 g/L和50 g/L激发时,与单纯哮喘组具有显著差异。肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞比例和血清中IgE含量也有一定程度增加,但差异不具有统计学意义,这可能与暴露的时间较短有关,因为我们早期对低浓度烟曲霉孢子慢性暴露进行了时间梯度(1、3、5周)的探索,发现哮喘大鼠气道嗜酸性细胞聚集程度和血清IgE水平随着烟曲霉孢子暴露的时间延长而增加[16]。嗜酸性细胞在真菌相关的哮喘病程中的作用至关重要,相关研究显示,真菌细胞壁组分β-D葡聚糖可以诱导嗜酸粒细胞脱颗粒[17]。我们前期研究也发现长期烟曲霉孢子吸入可促进嗜酸细胞趋化因子(Eotaxin)的生成,促进气道嗜酸性细胞募集活化,并加重气道高反应性[18]。
根据GINA指南[19],吸入性糖皮质激素因其良好的抗炎作用而被认为是哮喘的一线治疗方法,β2肾上腺素能受体激动剂是控制哮喘症状的重要药物,具有支气管舒张作用。但部分哮喘患者对常规糖皮质激素或β2肾上腺素能受体激动剂治疗效果并不满意。Vicencio[1]等人报道了一例儿童难治性哮喘的病例,给予该患者高剂量吸入性糖皮质激素、长效β2肾上腺素能受体激动剂联合白三烯受体拮抗剂以及抗组胺治疗后,哮喘症状仍持续不缓解;放射性变应原吸附试验显示患者对环境中多种真菌物质致敏,予以增加伊曲康唑治疗后,其哮喘症状、血清IgE水平和肺功能FEV1/FVC、FEV1%预计值等指标均趋于正常。过去研究也证实,外源性烟曲霉暴露或低剂量烟曲霉气道定植足以诱发过敏性炎症反应,加重哮喘症状,这类特殊的重症哮喘亚型被定义为真菌致敏性重症哮喘(severe asthma associated with fungal sensitization, SAFS)[20]。Denning[2]等人给予SAFS患者连续32周口服伊曲康唑治疗,随访16周后发现患者生活量表评分明显增高,肺功能显著改善。同样,在我们的临床工作中,对于部分持续性哮喘发作患者给予抗真菌治疗也取得了良好疗效。以上结果提示部分烟曲霉相关的重症哮喘或难治性哮喘患者可能对药物敏感性降低。本研究旨在阐明烟曲霉引起的糖皮质激素和β2肾上腺素能受体激动剂敏感性降低的可能分子机制。
相关研究表明,糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor, GCR)和β2肾上腺素能受体(β2-adrenergic receptor,ADRB2)在糖皮质激素和β2肾上腺素能受体激动剂起效过程中发挥重要作用,GCR和ADRB2数量的减少与该两种药物的敏感性降低有关[3-5, 21, 22]。我们发现气道烟曲霉暴露可降低肺组织GCR的表达,可能通过转录和翻译水平的调控减少其表达。GCR是糖皮质激素的结合位点,糖皮质激素主要通过细胞膜扩散进入细胞质,与胞质中的GCR结合后形成激素-受体复合物,由于激素受体构象的改变,受体的DNA结合区暴露,并使激素-受体复合物迅速定位于细胞核上,激活GCR二聚体并与糖皮质激素反应原件结合,调控抗炎基因以及抑炎基因,从而发挥抗炎效应[23]。目前发现的GCR主要包括GCRα和GCRβ两类亚型,GCRα能够结合糖皮质激素,发挥生理学、药理学作用,而GCRβ被认为是GCRα的内源性抑制因子。由于个体差异和外部因素影响,不同个体对激素的反应性各有差异,部分个体对糖皮质激素不敏感或反应性降低,称为糖皮质激素抵抗。许多临床研究表明,GCRα的密度及其与糖皮质激素的亲和力与糖皮质激素的疗效呈正相关。对糖皮质激素抵抗型(steroid-resistance,SR)哮喘患者的研究中发现,SR型哮喘患者外周血单个核细胞的GCR水平显著低于糖皮质激素敏感型(steroid-sensitive,SS)型哮喘患者,哮喘患者GCR水平的差异表明,在慢性哮喘中可能存在不同程度的GCR异常,其中以SR型哮喘最为严重,进一步说明T细胞GCR异常可能是导致细胞对糖皮质激素反应性降低的原因之一[24]。在其他疾病中,比如SR型系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞胞浆内GCRα的表达也显著低于SS型系统性红斑狼疮患者[25]。Tissing[26]等人的研究结果也显示,SR型急性淋巴细胞白血病患者白细胞GCRα的降低是激素抵抗的主要原因,GCRβ的mRNA表达水平与糖皮质激素抵抗无关。但是,在溃疡性结肠炎的研究中,Hausmann[27]等人发现正常受试者、新诊断溃疡性结肠炎、已停药患者、疾病活动期患者的GCRα和GCRβ mRNA表达结果无显著性差异,推测糖皮质激素敏感性与GCR mRNA水平无关,可能与激素和GCR的亲和力下降有关。不同病情程度哮喘患者的GCRα和GCRβ mRNA的检测结果显示,GCRα表达均高于GCRβ,但GCRα/β比值与糖皮质激素敏感性无明显相关性。Boardman[28]等人概括了一些可能影响糖皮质激素敏感性的因素,包括糖皮质激素在局部组织中的浓度、糖皮质激素受体的数量、与糖皮质激素受体的结合力以及糖皮质激素信号转导的调控等,说明激素反应性受多种因素综合影响。
同样的,β2肾上腺素能受体激动剂敏感性也受多种因素如年龄、疾病严重程度、环境因素等,以及β2肾上腺素能受体(β2-adrenergic receptor,ADRB2)基因多态性的影响[29-32]。ADRB2基因定位于染色体5q31-32,它编码的是一种G蛋白偶联受体,主要分布于气道平滑肌层,与支气管舒张有关。Moore[5]等人发现呼吸道合胞病毒感染可以减少ADRB2的数量,导致气道平滑肌对β2肾上腺素能受体激动剂的敏感性降低。但我们的实验结果显示哮喘大鼠和烟曲霉暴露吸入的哮喘大鼠,其肺组织ADRB2的表达与正常大鼠比较,并无显著性差异。相关研究显示,β2肾上腺素能受体激动剂在不同患者中的反应性差别主要与ADRB2的基因多态性相关[33]。研究发现ADRB2基因的第16位(rs1042713)和27位(rs1042714)的SNP可发生Arg16Gly、Gln27Glu改变,可导致儿童哮喘急性发作时对β2肾上腺素能受体激动剂反应性降低[29, 31]。Meta分析结果显示ADRB2基因rs1042713位点基因多态性与中国儿童哮喘易感性存在一定关联,携带G突变基因者可相对增加儿童哮喘的患病风险[34]。此外,β受体亲和力高低在介导气道平滑肌舒缩、维持气道正常功能中也起较大作用。气道功能的调节主要由肾上腺素能神经、胆碱能神经分别通过β、M受体介导而实现,正常人体内神经-受体功能处于动态平衡状态而维持气道正常功能。田曼[35]等人采用放射性配基结合分析法对呼吸道合胞病毒感染后豚鼠肺组织β、M受体密度和亲和力进行了动态观察,发现β受体亲和力降低是造成β受体失敏的主要原因,而β受体密度无显著改变,相反地,呼吸道合胞病毒感染可使肺组织低亲和力的M受体密度和亲和力均增加,而后者介导气道平滑肌收缩和促进过敏性物质释放,这种受体系统之间的失平衡可能是导致气道反应性增高的重要机制之一。
综上所述,激素抵抗、β受体失敏可能与受体表达量、各亚型之间的比例、基因多态性、受体亲和力,甚至基因突变等多种因素有关。本实验结果显示烟曲霉吸入明显降低了哮喘大鼠肺组织GCR的表达,可能会影响气道对激素的反应性;而烟曲霉吸入对哮喘大鼠肺组织ADRB2的表达无显著影响。该结果提醒我们,在诊治反复发作的激素抵抗型哮喘患者时,需警惕是否存在环境中烟曲霉暴露或气道烟曲霉定植。
本实验没有研究不同时间梯度和浓度梯度的烟曲霉暴露对肺内GCR和ADRB2表达水平的动态性改变,过敏原剂量、暴露时间与效应的关系也还不明确。真菌与难治性哮喘的关系越来越受到关注,相关的免疫调控机制亟待进一步研究。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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第二章
地塞米松/头孢曲松钠干预对烟曲霉气道定植以及气道微环境的影响
在慢性气道炎症状态下,气道微环境的改变可能有利于烟曲霉在气道内粘附和定植,而烟曲霉在肺内的长时间滞留,反过来又是气道炎症慢性化的主要原因。目前,对哮喘、真菌定植与气道微环境的关系研究较少。而由于呼吸道感染可诱发或加重哮喘,哮喘又可继发呼吸道感染,一些基层医疗单位除了给予哮喘患者糖皮质激素治疗以外,常把抗生素静脉滴注作为必备药物来用,药物使用对气道微环境是否影响目前尚不明确。本研究采用OVA致敏并激发建立大鼠哮喘模型,建模期间给予地塞米松/头孢曲松钠干预,并进一步给予烟曲霉孢子吸入,旨在初步探索地塞米松/头孢曲松钠干预对烟曲霉定植以及气道微环境的影响。
 
材料与方法
一、试剂材料与仪器
(一)实验动物
SPF级Wistar大鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司,生产许可证号:SCXK(沪)2012-0002,雄性,体重180~200g,实验前于复旦大学医学院动物房适应性饲养一周,恒温环境(23 ℃),相对湿度(40%),12小时昼夜,自由进食和取水,并观察生长情况。动物饲养及实验方案均严格按照复旦大学动物伦理委员会动物实验规范执行。
 
(二)烟曲霉菌株
AF293烟曲霉标准株为复旦大学附属华山医院真菌室保存菌株。由肺曲霉菌病患者临床痰液标本中分离,经鉴定后保存。
 
(三)试剂与材料
大鼠IL-33 ELISA试剂盒 美国R&D公司
乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒 南京建成生物工程研究所
酸性磷酸酶(ACP)测定试剂盒 南京建成生物工程研究所
注射用地塞米松磷酸钠注射液 马鞍山丰原制药
注射用头孢曲松钠 悦康药业集团有限公司
马铃薯葡萄糖琼脂培养基 上海盛思公司
其余试剂和材料同前。
 
(四)仪器设备
FinePointe™ NAM无创式动物肺功能检测分析仪 美国Buxco公司
血气、电解质生化分析仪(cobas b 221) 罗氏诊断产品(上海)有限公司
1ml 注射器
其余仪器设备同前。
 
二、实验方法和步骤
(一)动物分组及模型制备
56只雄性Wistar大鼠随机分为7组(n=8):空白对照组(CON组)、单纯孢子组(CON+AF组)、单纯哮喘组(OVA组)、哮喘+孢子组(OVA+AF组)、地塞米松干预组(OVA+DEX+AF组)、头孢曲松钠干预组(OVA+CEF+AF组)、联合干预组(OVA+DEX/CEF+AF组)。空白对照组、单纯孢子组、单纯哮喘组、哮喘+孢子组模型建立同第一章。地塞米松干预组大鼠于OVA激发期间给予每周3次(每周一三五,雾化前30分钟),0.5 mg/ kg 地塞米松腹腔注射;头孢曲松钠干预组大鼠于OVA激发期间给予每周3次(每周一三五,雾化前30分钟),50 mg/ kg 头孢曲松钠腹腔注射。联合干预组大鼠于OVA激发期间给予每周3次(每周一三五,雾化前30分钟),0.5 mg/ kg 地塞米松+50 mg/ kg 头孢曲松钠腹腔注射。第57天起,将各烟曲霉暴露大鼠于异氟烷麻醉后垂直位放置,用移液枪吸取100μL 1.0×107/mL 烟曲霉菌孢子悬液缓慢滴入每侧鼻腔,连续3天,其余各组给予生理盐水滴鼻作为对照。建模流程见图1。
 
(二)气道反应性测定
采用FinePointe™ NAM无创式动物肺功能检测分析仪,其原理是通过检测鼻部气流与胸部气流的相位差计算出特殊气道阻力(specific airway resistance,sRaw,cmH2O • sec-1 • ml-1)。
将大鼠置于双腔体积描记器,用不同浓度的乙酰甲胆碱溶液激发支气管哮喘(3.125,6.25,12.5,25和50 g/L),以PBS作为基线。通过FinePointe软件分析各组大鼠在不同浓度乙酰甲胆碱激发下sRaw的变化。sRaw增长率=(吸入不同浓度乙酰甲胆碱后sRaw测定值-吸入PBS后sRaw测定值)/吸入PBS后sRaw测定值。操作见图2。
 
 
 
图1:实验流程图
Figure1. Time schedule of the experimental procedures
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(三)手术和取材
方法同第一章。
 
(四)肺组织、BALF、全血烟曲霉培养
1.肺组织匀浆烟曲霉培养:
手术器械、1.5 mL Eppendorf管、锡箔纸、研磨钢珠、枪头、玻璃三角棒高压灭菌
 
无菌锡箔纸放入精细天平,调零;剪取1 mg左右肺组织,称重后放入装有研磨钢珠的Eppendorf管中,加入 PBS(1 mg/mL),将Eppendorf管放入预冷的组织匀浆机,60 Hz,60 s
 
取出装有匀浆液的Eppendorf管,取100 μL匀浆液均匀接涂布于加有双抗的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上
 
37℃恒温箱中培养,24 h观察烟曲霉菌落生长情况;若7天后仍无烟曲霉菌落生成,则认为培养结果为阴性
2.BALF、全血烟曲霉培养:各取 100 μL均匀涂布于加有双抗的马铃薯葡糖琼
脂培养基上,方法同上。
 
(五)肺组织过碘酸乌洛托品银染色(Periodic Acid-Silver Methenamine, PASM)染色
右肺上叶置于4%多聚甲醛中固定48 h,脱水、石蜡包埋,5 μm厚切片,进行PASM染色,方法如下:
石蜡切片常规脱蜡至水
 
1%过碘酸氧化15 min
 
蒸馏水冲洗2 min
 
2%硫酸铁铵10min,稍水洗
 
新鲜配制六胺银溶液,微波预热至60℃
 
六胺银工作液中,水浴箱60℃,30 min,水洗
 
5%硫代硫酸钠处理1 min,水洗
 
复染苏木精 5min水洗,1%盐酸乙醇分化,碳酸锂水溶液促蓝水洗;伊红复染60 s水洗
 
梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片
结果:真菌孢子呈明显的黑色,黏液呈红色,细胞核呈红色。
 
(六)BALF中嗜酸粒细胞计数及血清IgE检测
方法同第一章。
 
(七)全血pH值和电解质测定
全血收集后(0-4℃保存)取2 mL立即使用罗氏血气分析仪测定pH值和电解质浓度。
 
(八)BALF和血清中总蛋白浓度测定
按BCA蛋白测定试剂盒说明书进行,具体步骤如下:
BCA工作液的配制:根据样品数量(每孔200 μL),将solution A和solution B以50:1的体积混匀配制成BCA工作液,室温24 h内稳定
 
蛋白标准品BSA的准备:取0.8 mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准(20 mg BSA)中,充分溶解后配制成25 mg/mL 的蛋白标准溶液,-20 ℃保存;取适量25 mg/mL 蛋白标准溶液用PBS稀释至终浓度为0.5 mg/mL的工作液(BSA工作液)待用
 
将BSA工作液按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔,加PBS补足到20 μL
 
将1 μL BALF+19 μL PBS,1 μL血清+19 μL PBS加入96孔板中(根据预实验结果,BALF予4倍稀释,血清予100倍稀释后使用)
 
每孔各加入200 μL BCA工作液,轻轻用加样枪混匀,用锡纸包裹避光,37 ℃温箱孵育30 min
 
用酶标仪测定波长A562的吸光度
 
根据标准曲线和使用样品体积及稀释倍数计算出BALF和血浆的蛋白浓度
 
(九)BALF和血清中乳酸脱氢酶(LDH)测定:微板法
按LDH测试盒说明书进行,具体步骤如下:
空白孔 标准孔 测定孔 对照孔
双蒸水(μL) 25 5 5
0.2mmol/L标准液(μL) 20
待测样本(μL) 20 20
基质缓冲液(μL) 25 25 25 25
辅酶I(μL) 5
混匀,37 ℃温浴15 min
2,4-二硝基苯肼(μL) 25 25 25 25
混匀,37 ℃温浴15 min
0.4mol/LNaOH溶液(μL) 250 250 250 250
混匀,室温放置5 min,波长450 nm,酶标仪测定吸光度
 
血浆、液体样本LDH定义:1000 ml血浆或液体样本37℃与基质作用15 min,在反应体系中产生1 μmoL丙酮酸为1 单位,计算公式为:
 
样本中LDH活性(U/L) = 测定OD值-对照OD值 × 标准品浓度
(0.2mmol/L) × 1000
标准OD值-空白OD值
 
(十)BALF和血清中酸性磷酸酶(ACP)测定:微板法
按LDH检测试盒说明书进行,具体步骤如下:
空白孔 标准孔 测定孔
双蒸水(μL) 4
0.1mg/mL酚标准应用液(μL) 4
待测样本(μL) 4
缓冲液(μL) 40 40 40
基质液(μL) 40 40 40
充分混匀37 ℃温浴30 min
碱液(μL) 80 80 80
显色剂(μL) 80 80 80
轻轻振摇孔板混匀,静置10 min,波长520 nm,酶标仪测定各孔吸光度
 
血浆、液体标本ACP定义:100 mL血浆或液体样本在37 ℃与基质作用30 min 产生1 mg酚为1个金氏单位,计算公式如下:
 
样本中ACP活力(金氏单位/100 mL) = 测定OD值-对照OD值
×
酚标准品
浓度(0.1mg/mL) × 100 mL × 样本测定前稀释倍数
标准OD值-空白OD值
 
(十一)BALF中IL-33测定:ELISA法
按IL-33检测试剂盒说明书进行,具体操作如下:
准备工作:
1. 空白对照品(Control):1 mL 双蒸水加入空白对照品粉剂中,充分混匀。
2. 1×洗涤液(Wash Buffer):浓缩洗涤液(25×)用双蒸水稀释成1×:即1份浓缩洗涤液加入24份双蒸水。
3. 配制标准品(Standard):用标准品稀释液(Calibrator Diluent RD5-17)将标准品配成初始浓度为2000 pg/mL。
配制1000 pg/mL → 31.3 pg/mL标准品:准备6只Eppendorf管,每管加200 μL标准品稀释液,分别标记上1000 pg/mL,500 pg/mL,250 pg/mL,125 pg/mL,62.5 pg/mL,31.3 pg/mL。取200 μL 2000 pg/mL的标准品加入标记1000 pg/mL的管中,混匀后同样取出200 μL,加入下一只管中,余同此类推,直到最后一管。标准品稀释液作为零孔。
4. 显色液(Substrate solution):A液与B液等体积混合,使用前15 min内配制,避光保存。
5. 试剂盒应平衡至室温再试验。
操作步骤:
将样品稀释液(Assay Diluent RD1-40)各50 μL依次加入96孔板中
 
将标准品、空白对照品各50 μL依次加入一排8孔中,1孔只加稀释液的作为零孔
 
加样:待测品每孔各加入待测样品50 μL,轻轻混匀
 
酶标板加封板膜,室温反应120 min
 
洗板:甩去酶标板内液体,再对着滤纸拍几下,用洗涤液将反应板充分洗涤5次,在滤纸上拍干
 
按每孔100 μL依次加入酶标抗体(IL-33 Conjugate),酶标板加封板膜,室温避光反应120 min
 
洗板:方法同上
 
按每孔100 μL依次加入显色液,室温避光反应30 min
 
按每孔100 μL依次加入终止液,此时蓝色立转黄色
 
用酶标仪在450 nm测定吸光值(OD值)
结果计算:
1. 所有标准品和样品的OD值都应减去零孔的OD值后再进行计算。
2. 以标准品浓度2000、1000、500、250、125、62.5、31.3 pg/mL作为纵坐标,对应OD值作为横坐标,坐标纸上画出标准曲线。
3. 根据样品OD值在该曲线上查出相应IL-33含量。
 
(十二)肺组织IL-33 mRNA检测
1. 大鼠肺组织RNA提取:Trizol法
具体步骤:
100 mg 大鼠肺组织放入1.5 mL 无酶Eppendorf管中,加500 μLTrizol,放入研磨小钢珠,将Eppendorf管放入预冷的组织匀浆机中,60 Hz,60 s
 
取出装有匀浆液的Eppendorf管,室温静置5 min,加入100 μL氯仿,用力震荡Eppendorf管15 s充分混匀,接着4 ℃,12000 rpm/min离心15 min
混悬液分三层:上层为RNA水相,中间薄层为DNA,下层为蛋白有机相层,有组织块沉淀
 
将上清(内含RNA)转移至新的无酶Eppendorf管,加入250 μL异丙醇,轻轻混匀,室温静置10 min,4 ℃,12000 rpm/min离心10 min,RNA沉淀至管底
 
用移液枪吸弃上清,底部少量沉淀为RNA,空气干燥管壁,加入500 μL 75%乙醇洗涤RNA,轻轻震荡几次后4 ℃,12000 rpm/min离心5 min,吸弃上清
 
将移液枪将Eppendorf管内壁吸干,室温放置至管壁恰好干燥,加入适量DEPC水(20~50 μL,根据沉淀多少而定),移液枪轻轻吹打溶解
2. RNA纯度和浓度测定
具体步骤:
测定前用1 μL双氧水冲洗加样孔,吸纸擦净
 
移液枪于加样孔加入1 μL DEPC水,设为空白对照
 
移液枪吸取1 μL提取的RNA加入加样孔中,紫外线分光光度仪上分别读取在260 nm和280 nm波长处的吸光度A值
 
纯度测定:A260nm/A280nm比值于1.8~2.0之间,说明所提取的RNA未被降解,纯度高,可用于后续实验
 
浓度测定:根据260 nm下的吸光度,获得RNA浓度即可
3. 逆转录合成cDNA
采用TOYOBO公司的逆转录试剂盒,试验步骤如下:
总反应体系为20 μL,200 μL无酶Eppendorf管中依次加入:
Nuclease-free Water:20-样本量-Master Mix量
5×Master Mix:4 μL;
RNA样本:2000/RNA浓度μL;
 
轻轻混匀,离心至管底
 
PCR仪中逆转录即得总cDNA,-20 ℃冰箱保存备用
4. 实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)
(1):IL-33序列由Genebank获得,引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成,引物序列如下:
β-actin片段大小150 bp
上游:5′- GCAGGAGTACGATGAGTCCG -3′
下游:5′- ACGCAGCTCAGTAACAGTCC -3′
IL-33片段大小121bp
上游:5′- GCCCTGAGCACATACAACGA -3′
下游:5′- CGTAGTAACGGAGTAGCACCTT -3′
(2)反应过程:
采用TOYOBO公司的SYBR Green PCR试剂盒:10 μL反应体系
目的基因引物 各0.4 μL
SYBRGreen Mix 5 μL
Plus 1 μL
ddH2O 2.2 μL
cDNA 1 μL
震荡混匀短暂离心后放入PCR仪,设置循环参数为:95 ℃预变性15 s;95 ℃变性15 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸45 s,共40个循环;95 ℃15 s,60 ℃ 60 s,使产物稳定。所得产物于-20 ℃保存。
5. 结果分析
实验数据采用仪器自带分析软件,根据所测CT值,通过2‐ΔΔCT计算各组IL-33 mRNA的相对含量。
 
结果
一、各组大鼠气道反应性的比较
与空白对照组(CON组)比较,单纯哮喘组(OVA)的特殊气道阻力sRaw变化值随着乙酰甲胆碱浓度的增加而不断增加,在乙酰甲胆碱浓度为25 mg/mL时达到最高峰,差异具有统计学意义(P<0.05)。哮喘+孢子组(OVA+AF组)的sRaw变化值在不同浓度乙酰甲胆碱激发时均略高于单纯哮喘组(OVA组),但差异无统计学意义。各药物干预组的sRaw变化值虽然随着乙酰甲胆碱浓度的增加而上升,但均低于哮喘+孢子组(OVA+AF组),并接近于空白对照组。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图3:各组气道高反应性的变化
Figure 3: Changes in airway responsivenessof the rats in different groups
 
二、各组大鼠BALF中嗜酸粒细胞比例
空白对照组(CON组)、单纯孢子组(CON+AF组)、单纯哮喘组(OVA组)、哮喘+孢子组(OVA+AF组)组间比较见第一章。与哮喘+孢子组(OVA+AF组)比较,地塞米松干预组(OVA+DEX+AF组)BALF中嗜酸性细胞比例显著降低,差异有统计学意义(图4,P<0.05),且地塞米松干预组(OVA+DEX+AF组)大鼠BALF中的嗜酸性细胞比例接近于空白对照组(CON组),差异无统计学意义,说明地塞米松干预组大鼠气道中嗜酸性细胞聚集情况趋向于正常。但头孢曲松钠干预组(OVA+CEF+AF组)和联合干预组(OVA+DEX/CEF+AF组)组大鼠BALF中嗜酸性细胞比例与哮喘+孢子组(OVA+AF组)无显著性差异(P>0.05)。
 
三、各组大鼠血清IgE水平
空白对照组(CON组)、单纯孢子组(CON+AF组)、单纯哮喘组(OVA组)、哮喘+孢子组(OVA+AF组)组间比较见第一章。与哮喘+孢子组(OVA+AF组)比较,地塞米松干预组(OVA+DEX+AF组)和联合干预组(OVA+DEX/CEF+AF组)血清IgE水平有一定程度降低,但差异无统计学意义(图4,P>0.05);头孢曲松钠干预组(OVA+CEF+AF组)血清IgE水平较哮喘+孢子组(OVA+AF组)无明显改变。
 
 
图4:各组大鼠BALF中嗜酸粒细胞比例(A)和血清中IgE水平(B)与CON组比较,**P< 0.01;与OVA+AF组比较,#P< 0.05)
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure 4: The percentage of eosinophil in BAL fluid(A)and the level of IgE in serum (B) . (**P< 0.01 versus CON groups,#P< 0.05versus OVA+AF groups)
 
四、烟曲霉在大鼠气道和肺实质内定植的观察
应用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养观察大鼠肺组织、BALF以及全血烟曲霉菌落的生长情况。马铃薯葡萄糖琼脂培养结果见表1。
应用PASM染色来显示大鼠肺内的烟曲霉孢子和菌丝。吸入烟曲霉孢子后,无论哮喘+孢子组(OVA+AF组)还是单纯孢子组(CON+AF组)大鼠的气道和肺实质内均未发现烟曲霉菌丝生成,各药物干预组大鼠肺实质内也未见菌丝生成。哮喘+孢子组(OVA+AF组)及各药物干预组大鼠肺实质内可见烟曲霉孢子滞留,而单纯孢子组(CON+AF组)无此现象。
表1:肺组织匀浆、BALF及全血培养
肺组织匀浆 BALF 全血
CON组 0(0/8) 0(0/8) 0(0/8)
CON+AF组 0(0/8) 0(0/8) 0(0/8)
OVA组 0(0/8) 0(0/8) 0(0/8)
OVA+AF组 50%(4/8) 50%(4/8) 0(0/8)
OVA+DEX+AF组 100%(7/7) 57%(4/7) 0(0/7)
OVA+CEF+AF组 50%(4/8) 50%(4/8) 0(0/8)
OVA+DEX/CEF+AF组 67%(4/6) 0(0/6) 0(0/6)
注:各组分别为:空白对照组(CON组)、单纯孢子组(CON+AF组)、单纯哮喘组(OVA组)、哮喘+孢子组(OVA+AF组)、地塞米松干预组(OVA+DEX+AF组)、头孢曲松钠干预组(OVA+CEF+AF组)、联合干预组(OVA+DEX/CEF+AF组)。其中OVA+DEX+AF组死亡1只,OVA+DEX/CEF+AF组死亡2只。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图5:大鼠肺内的烟曲霉孢子(PASM×200)。哮喘+孢子组(B)、地塞米松干预组(C)、头孢曲松钠干预组(D)、联合干预组(E)肺组织内可见烟曲霉孢子滞留(图中黑色点状物质),单纯孢子组(A)未见孢子滞留。各组大鼠肺实质内均未发现烟曲霉菌丝生成。
Figure 5:A. fumigatus spores in lung tissue (PASM×200). Periodic acid-silver metheramine (PASM) stained sectionsfrom OVA+AF groups (B), OVA+DEX+AF groups(C), OVA+CEF+AF groups(D), OVA+DEX/CEF+AF groups(E) showing entire or degraded fungal spores (black material) in lung tissue while no fungal spores were found in CON+AF groups (A).
五、各组大鼠血和BALF中pH值及电解质的含量
与空白对照组(CON组)相比,单纯孢子组(CON+AF组)和单纯哮喘组(OVA组)血和BALF中K+浓度的改变无统计学差异。与单纯哮喘组(OVA组)比较,可见哮喘+孢子组(OVA+AF组)血中K+浓度降低且BALF中K+浓度升高。哮喘+孢子组(OVA+AF组)和单纯哮喘组(OVA组)两组间血和BALF的浓度差存在显著性差异(图6B,P<0.05)。与哮喘+孢子组(OVA+AF组)比较,联合干预组(OVA+DEX/CEF+AF组)血中K+浓度有所升高而BALF中K+浓度有所降低,血和BALF二者间的K+浓度差与哮喘+孢子组(OVA+AF组)具有显著性差异,且趋向于空白对照组(CON组)。与空白对照组(CON组)比较,单纯孢子组(CON+AF组)血中Ca2+水平升高明显,而单纯哮喘组(OVA组)升高不明显;哮喘+孢子组(OVA+AF组)与单纯孢子组(OVA组)间血中Ca2+水平也无显著性差异;各药物干预组血中Ca2+水平较哮喘+孢子组(OVA+AF组)也无明显改变。此外,各组间血和BALF中的Na+、Cl-及pH值无显著性差异。各组BALF中Ca2+因浓度太低而检测不到。见图6。
 
六、各组大鼠血清和BALF中总蛋白、LDH、ACP的含量
由图7可见,单纯孢子组(CON+AF组)和单纯哮喘组(OVA组)血清和BALF中的总蛋白量与空白对照组(CON组)比较无显著性差异。哮喘+孢子组(OVA+AF组)血清和BALF中的总蛋白量均明显高于单纯哮喘组(OVA组),差异具有统计学意义(分别P< 0.05,P< 0.01)。与哮喘+孢子组(OVA+AF组)相比,地塞米松干预组(OVA+DEX+AF组)血清和BALF中的总蛋白量无明显改变,而头孢曲松钠干预组(OVA+CEF+AF组)和联合干预组(OVA+DEX/CEF+AF组)血清和BALF中的总蛋白量显著减少,差异具有统计学意义(P< 0.05或P< 0.01)。各组间血清LDH活力无显著性差异,血清ACP活性在头孢曲松钠干预组(OVA+CEF+AF组)明显降低。各组大鼠BALF中检测不到LDH和ACP活性。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图6:各组大鼠血和BALF中电解质含量和pH值的比较。K+(A)、K+浓度差(B)、Na+(C)、Cl-(D)、Ca2+(E)和pH值(F)。(与CON组比较,*P< 0.05;与OVA组比较,+P< 0.05;与OVA+AF组比较, #P< 0.05)
Figure 6: Electrolytes including K+ (A), Na+ (C), Cl- (D), Ca2+ (E) and pH values (F) were detected in blood and BALF; The difference of K+ levels between BALF and blood in rats were showed (B).(*P< 0.05 versus CON groups; +P< 0.05 versus OVA groups;#P< 0.05versus OVA+AF groups)
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图7:各组大鼠血和BALF中总蛋白含量(A和B)、LDH活性(C)及ACP活性(D)的比较。(与OVA组比较,+P< 0.05,++P< 0.01;与OVA+AF组比较, #P< 0.05,##P< 0.01)
Figure 7: The levels of total protein (A and B), and the activity of LDH (C) and ACP (D) in serum and BALF. (+P< 0.05 and ++P< 0.01versus OVA groups;#P< 0.05 and ##P< 0.01versus OVA+AF groups)
 
七、各组大鼠BALF中IL-33因子和肺组织中IL-33mRNA的表达
由图8可见,单纯哮喘组(OVA组)BALF中的IL-33因子和肺组织中的IL-33 mRNA含量均显著高于空白对照组(CON组),差异具有统计学意义(P< 0.05)。而单纯孢子组(CON+AF组)BALF中的IL-33因子和肺组织中的IL-33 mRNA含量与空白对照组(CON组)比较无显著性差异。与单纯哮喘组(OVA组)比较,哮喘+孢子组(OVA+AF组)BALF中的IL-33因子和肺组织中的IL-33 mRNA含量均有升高的趋势,但差异无统计学意义。与哮喘+孢子组(OVA+AF组)相比,三组药物干预组BALF中的IL-33因子含量均显著降低(P<0.05或P<0.01),以地塞米松干预组(OVA+DEX+AF组)下降最为显著。地塞米松干预组(OVA+DEX+AF组)和联合干预组(OVA+DEX/CEF+AF组)肺组织中IL-33 mRNA的表达也较哮喘+孢子组(OVA+AF组)明显减少。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图8:各组大鼠BALF中IL-33因子含量(A)和肺组织中IL-33 mRNA
的表达(B)。(与CON组比较,*P< 0.05;与OVA+AF组比较,##P<
0.01,#P< 0.05)
Figure 8: The levels of IL-33 in BALF (A) andthe expression of IL-33 mRNA in the lung (B).(*P< 0.05 versus CON groups,##P< 0.01and#P< 0.05versus OVA+AF groups)
 
讨论
哮喘是最常见的呼吸道慢性疾病之一,近年来其患病率及病死率在全球范围内有上升的趋势。引起哮喘发作的因素较为广泛,包括感染、吸入过敏原、食物、药物、运动以及精神因素等。其中,呼吸道感染是引起哮喘急性发作的最主要诱因之一。呼吸道感染可诱发或加重哮喘,而哮喘又可继发呼吸道感染,两者相互影响,可形成恶性循环。目前,呼吸道病毒感染被认为与哮喘急性发作关系最为密切[1-4]。有研究表明,大约50%的成人哮喘急性发作与呼吸道病毒感染有关[4]。在临床上,除了给予哮喘患者糖皮质激素治疗以外,常把抗生素静脉滴注常作为必备药物来用,但病毒感染抗生素治疗无效。一份哮喘患者抗生素使用情况调查显示,各级医院对非细菌感染者均不同程度使用了抗生素,以诊所尤为普遍,高达98%,而县镇级医院和省市级医院相对较少,分别为71%和38%[5]。当哮喘合并呼吸道感染时,未能正确识别致病菌而滥用抗生素,不仅造成家庭及社会经济负担,还带来许多不良反应,增加耐药菌株,也使得真菌感染的机会增加。
本研究中,我们采用Wistar大鼠行OVA致敏并激发复制哮喘模型,期间给予地塞米松和头孢曲松钠单独或联合干预,进一步行烟曲霉暴露,通过动物模型模拟哮喘患者在使用激素和抗生素的情况下,观察烟曲霉气道定植以及肺内清除的情况。我们发现肺组织匀浆烟曲霉阳性率在地塞米松干预组高达100%,其原因可能为:糖皮质激素可抑制免疫过程的多个环节,包括对巨噬细胞吞噬、处理抗原作用的抑制及细胞免疫的抑制;糖皮质激素还能增强烟曲霉孢子的侵袭力,并具有时间和浓度依赖性[6]。肺组织匀浆烟曲霉阳性率在哮喘+孢子组、头孢曲松钠干预组和联合干预组也较高,分别为50%、50%、67%。PASM肺组织染色也显示哮喘+孢子组、头孢曲松钠干预组、地塞米松干预组和联合干预组大鼠肺实质内存在烟曲霉孢子滞留,而单纯孢子组肺实质内未见烟曲霉孢子滞留。这表明,在正常免疫功能状态下,呼吸道的防御功能可通过咳嗽、黏液纤毛运动以及肺泡巨噬细胞吞噬等形式将致病物质及时排出、灭活及清除。呼吸道分泌物中含有的溶菌酶、补体等免疫因子也有助于杀灭吸入的微生物。但是,哮喘慢性过敏性炎症所致的Th2型细胞因子大量产生,上皮细胞损伤脱落以及基底膜的裸露,均有利于烟曲霉孢子在气道内粘附以及肺内滞留[7]。而广谱抗生素的大量使用使得人体正常菌群中的敏感菌株被杀灭,正常菌群的保护作用被破坏,菌群失调进而使外源性或内源性真菌得以大量繁殖,造成真菌二重感染。此外,本实验中BALF烟曲霉培养阳性率在哮喘+孢子组以及各药物干预组差异较小,其原因可能与本实验烟曲霉孢子暴露时间及取材时间较短有关,烟曲霉粘附、定植、侵袭需要相对长的过程。Lin[8]等人在免疫抑制的侵袭性肺曲霉菌病大鼠模型中发现在烟曲霉吸入后第1、3天未检测出血液中烟曲霉DNA,而在第5、7天烟曲霉DNA在血液中的检出率分别高达50%和66.7%,而本实验各组大鼠血培养均为阴性。综合以上结果,哮喘状态、激素和抗生素干预可能主要影响了肺泡巨噬细胞吞噬和清除孢子的能力,使大量孢子滞留于肺泡内,这就为烟曲霉侵袭和感染提供了便利的条件。所以,哮喘合并呼吸道感染时,必须正确识别致病菌,及时有效地控制感染,合理使用糖皮质激素、抗生素等药物,避免真菌二重感染。
哮喘的主要特征为气道慢性非特异性炎症、可逆性气流受限、气道高反应性。在变态反应性炎症中,炎性细胞浸润以及分泌物细胞因子等可能使气道所处的微环境发生改变。研究发现,在慢性气道炎症黏液高分泌状态下,气道微环境改变有助于铜绿假单胞菌在气道内的粘附与定植,从而形成生物膜[9]。气道黏液由分泌液和组织漏出液组成,含有水、蛋白质、电解质、脂质等,黏液的粘稠度与弹性(取决于高度糖基化的高分子量黏蛋白MUC的含量)能影响纤毛的运动。我们过去的研究发现,慢性烟曲霉暴露可上调哮喘大鼠气道黏蛋白MUC5AC表达,这种改变又有利于烟曲霉的粘附与定植[10]。本研究中,我们发现哮喘大鼠血和气道中的各种理化因素如电解质、pH值、蛋白含量以及LDH、ACP活性均没有明显改变。而烟曲霉暴露和地塞米松干预却使哮喘大鼠血中的K+浓度降低,气道灌洗液中的K+浓度升高。低钾血症是哮喘急性发作期的主要并发症之一,常见于老年人伴多种慢性疾病者。对126例哮喘患者血钾水平分析发现,哮喘组低钾血症发生率(28.6%)明显高于肺炎对照组(7.3%)[11]。一份56例哮喘患儿急性发作时的血钾测定报告中发现,低钾血症发生率也高达37.5%[12]。本研究中烟曲霉暴露造成哮喘大鼠血钾降低的可能原因为哮喘大鼠过度通气可能引起呼吸性碱中毒,血H+浓度降低使细胞内H+转移到细胞外,H+-K+交换又使K+进入细胞内而引起转移性低钾血症[13]。地塞米松的应用可以使细胞外K+内流,也可使钾从尿中大量排出,导致低钾血症[14]。低钾可带来许多不良影响,低钾引起的代谢性碱中毒使氧解离曲线左移,血红蛋白释放氧气的能力下降,加重组织缺氧;低钾可使呼吸机疲劳,重者可至呼吸衰竭[15]。这些低钾引起的不良反应可能是烟曲霉加重哮喘症状的机制之一。
最新研究证实,气道高反应性与气道平滑肌收缩有关[16]。其中,钾离子通道的开放能使平滑肌细胞内超级化,从而阻断平滑肌的动作电位,介导支气管扩张,抑制气道高反应性及神经反射[17]。早期研究发现,细胞膜钾离子通道开放在β-肾上腺素能受体激动剂激活β-肾上腺素能受体的过程中起重要作用,介导支气管舒张[18]。但在本研究中,烟曲霉暴露的哮喘大鼠其血液和气道中是否发生钾离子流动以及是否有离子通道参与,钾离子浓度的变化在该模型中作用是保护性的还是破坏性的,这些问题目前仍不清楚。
本研究中还发现烟曲霉暴露使哮喘大鼠血清和BALF中总蛋白含量明显升高,头孢曲松钠干预或地塞米松联合头孢曲松钠干预后,血清和BALF中总蛋白量显著降低,而LDH和ACP水平变化不明显。BALF中总蛋白量的增加反映出肺毛细血管通透性增高,在脂多糖和盐酸氨溴索诱导的肺损伤动物模型中,BALF中的总蛋白量也都明显上升[19, 20]。真菌致敏是难治性哮喘和重症哮喘的主要原因之一,可能通过使肺组织以及肺毛细血管通透性增高,导致哮喘慢性气道炎症反应迁延不愈。头孢曲松钠在本实验中具有较好改善肺毛细血管通透性、减少蛋白渗出的作用,但是否应用抗生素仍需综合考虑,权衡利弊。
Th1/Th2比例失调、Th2细胞过度活化所产生的Th2型细胞因子在哮喘病程中起重要作用。我们过去的研究发现烟曲霉暴露可使哮喘大鼠肺组织Th2细胞因子IL-5和IL-13的表达明显升高[21]。IL-33是近年来被发现的一种前炎症因子,在重症哮喘的气道上皮和平滑肌上都有表达,它通过与其配体ST2结合,刺激2型固有淋巴细胞分泌大量的IL-5和IL-13,参与炎症以及过敏反应[22-25]。全基因组相关性分析也已证实IL-33基因与哮喘相关[26]。本研究中,哮喘大鼠BALF中的IL-33因子和肺组织中的IL-33 mRNA表达均较健康大鼠显著增高,吸入烟曲霉孢子后,IL-33水平进一步上升趋势,但差异没有统计学意义,这可能与暴露时间较短有关。地塞米松预处理对肺组织IL-33的表达具有明显的抑制,又能缓解气道高反应性、降低气道嗜酸性细胞比例和血清IgE水平,后者可能是通过抑制IL-33而起作用。IL-33基因敲除的慢性哮喘小鼠模型,其气道炎症、气道高反应、血清IgE含量以及气道重塑性改变等均显著改善[25]。因此,IL-33的发现和固有免疫的研究,拓宽了我们对哮喘的认识,IL-33作为新的治疗靶点可能具有重要研究价值,一方面减少了激素使用带来的真菌感染风险,另一方面对糖皮质激素抵抗型哮喘的治疗带来希望,对于IL-33的阻断治疗效果需进一步证实。
综上所述,本研究在慢性哮喘大鼠模型上初步探索了烟曲霉孢子吸入、地塞米松和头孢曲松钠应用对哮喘大鼠血液和气道内微环境(pH、电解质、蛋白、理化因素)的影响,主要表现为血钾降低、气道内蛋白渗出以及IL-33基因表达的改变,但对其具体机制以及所产生的影响需进一步研究。地塞米松和头孢曲松钠的应用使气道和肺组织内烟曲霉孢子滞留、难以清除,增加了真菌气道定植甚至肺内感染的风险,在哮喘治疗中需合理使用糖皮质激素、抗生素等药物,避免真菌二重感染。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
参考文献
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致谢
当键盘敲下论文的最后一个句号时,三年的硕士生涯也将划上句点。此时,过往的点点滴滴重临心头,甚为感慨。难以忘记初入实验室时的新奇和紧张,实验失败时的失落和感伤,稍有实验结果时的欣喜和安慰,以及每次孤立无助时获得的鼓励和帮助。这三年的经历必将成为我一生的宝贵财富。
首先,最衷心感谢我的导师。。。教授,感谢导师三年来的悉心栽培和无微不至的关怀。从实验的设计、实施至论文定稿,都是在导师的悉心指导下完成,无不凝聚着导师的心血和智慧。您不仅教会我做事,还教我如何做人,您严谨的科研态度,一丝不苟的工作作风,深深影响着我,让我受益匪浅。
衷心感谢。。。。。呼吸病研究所的。。。。。!是你们给我提供了设备先进、技术一流的实验室,让我得以顺利完成实验。感谢。。。研究员对我实验思路上的指导和帮助,感谢。。为我提供试剂和耗材上的后勤保障,在这个大家庭我感到非常温暖。
衷心感谢教育处。。。。。。。。。。。。。呼吸科。。。老师等所有领导和老师在工作上和生活上的关心和帮助。
衷心感谢粟慧琳同学无私地提供烟曲霉菌株。感谢。。。。。。。。王宇老师和周珊珊同学给予肺功能检测实验上的指导和帮助。
衷心感谢。。。。。。。。所有师兄弟姐妹,你们既是我的良师又是我的益友。你们的鼓励陪伴我走出一个个失败,勇敢战胜困难。
衷心感谢我的室友赵月华、李菁和刘倩倩,三年的朝夕相处让我们情同姐妹,大家相互鼓励和支持,彼此安慰,走过各自的低谷。
最后深深感谢父母对我的养育之恩,尽管已到了反哺的年龄,你们还是在经济上和精神上坚定的支持我,你们的的爱永远是最无私的;感谢挚爱的携手相伴,你的出现是上天赐我的最好礼物!