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水杨酸钠通过激活AMPK调控细菌LPS刺激的人单核细胞

来源:论文帮手 作者: 发布日期:2017-12-09 11:47:06

 

主要缩略词表
 
索引 缩写 英文名称 中文名称
A AMPK Adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase 腺苷酸活化蛋白激酶
AICAR 5-Aminoimidazole-4-carboxamide-1-b-ribofuranoside 5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸
B BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白
C COX Cyclooxygenase 环氧酶
D DMSO Dimethylsulfoxide 二甲亚砜
E EdU 5-ethynyl-2´-deoxyuridine 5-乙炔-2´-脱氧尿苷
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay 酶联免疫吸附试验
F FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清
I IL-1β Interleukin-1beta 白介素-1β
IL-6 Interleukin-6 白介素-6
iNOS Inducible Nitric Oxide Synthase 诱导型一氧化氮合酶
L LPS Lipopolysaccharide 脂多糖
M mTOR Mammalian target of rapamycin 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白
N NLRP3 NLR family, pyrin domain-containing 3 炎性小体3
Nrf2 Nuclear factor erythroid 2-related factor 核因子NF-E2相关因子
P PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液
PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride 苯甲基磺酰氟
PTEN Phosphatase and tensin homolog 同源性磷酸酶-张力蛋白
R ROS Reactive oxygen species 活性氧
S STAT3 signal transducer and activator of transcription 3 信号转导及转录激活因子3
NaSal/Sal Sodium salicylate 水杨酸钠
T TNF-α Tumor necrosis factor-alpha 肿瘤坏死因子-α
TXA2 Thromboxane A2 血栓素A2
 
 
 
 
 
 
中文摘要
水杨酸钠通过激活AMPK调控细菌LPS刺激的人单核细胞THP-1炎症反应
【背景】
水杨酸钠是一种非甾体类抗炎药物,其药理机制主要是抑制环氧酶、血小板源血栓素A2和NF-κB信号通路。最新研究表明水杨酸钠可激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK),AMPK通路是否参与水杨酸钠炎症调节反应尚不清楚。
【目的】
本研究旨在探讨水杨酸钠激活AMPK通路对LPS诱导的人单核细胞THP-1炎症样反应的影响及机制。
【方法】
培养THP-1细胞,分别给予或不给予10ug/ml LPS和5mM水杨酸钠刺激THP-1,静置培养24h。用western blot方法测定Bcl2蛋白,流式细胞仪检测Annexin V/PI染色,比较细胞凋亡变化。用western blot方法测定增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白,流式细胞仪检测EdU标记细胞,比较细胞增殖变化。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测促炎因子TNF-α, IL-1β, 和IL-6分泌变化。
【结果】
LPS刺激的THP-1细胞经水杨酸钠处理后,AMPK激活、凋亡增加、增殖减少、TNF-α 和IL-1β分泌增加。AMPK抑制剂Compound C可逆转上述效应。AMPK激活后可抑制 LPS诱导的信号转导及转录激活因子3(STAT3)磷酸化,Compound C可逆转激活的AMPK对STAT3的作用。
【结论】
AMPK激活对水杨酸钠调节的炎症反应发挥重要作用,包括诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、抑制STAT3活性、促进促炎因子TNF-α 和IL-1β分泌。
【关键词】水杨酸钠;脂多糖;AMPK;细胞凋亡;增殖;细胞因子;STAT3
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Abstract
   Sodium Salicylate Modulates Inflammatory Responses Through AMP-Activated Protein Kinase Activation in LPS-stimulated THP-1 cells
Candidate:Bao Weiwei
Supervisor : Prof. Mei Wei
Department of Anesthesiology, Tongji Hospital, Tongji Medical College,
Huazhong University of Science and Technology
【Background】
Sodium salicylate (NaSal) is a nonsteroidal anti-inflammatory drug. The putative mechanisms for NaSal’s pharmacologic action include the inhibition of cyclooxygenases, platelet-derived thromboxane A2 and NF-κB signaling. Recent studies demonstrated that salicylate could activate AMP-activated protein kinase (AMPK), an energy sensor that maintains the balance between ATP production and consumption. The anti-inflammatory action of AMPK has been reported to be mediated by promoting mitochondrial biogenesis and fatty acid oxidation. However, the exact signals responsible for salicylate-mediated inflammation through AMPK are not well-understood.
【Purpose】
The purpose of this study was to investigate the potential effects of AMPK activated by NaSal on inflammation-like responses of THP-1 monocytes to lipopolysaccharide (LPS) challenge.
【Methods】
THP-1 cells were stimulated with or without 10ug/ml LPS for 24 h in the presence or absence of 5mM NaSal. Apoptosis was measured by flow cytometry using Annexin V/PI staining and by western blotting for Bcl-2. Cell proliferation was detected by EdU incorporation and by western blot analysis for proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Secretion of pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β, and IL-6) was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
【Results】
Activation of AMPK by NaSal was accompanied by induction of apoptosis, inhibition of cell proliferation and increasing secretion of TNF-α and IL-1β in LPS-stimulated THP -1 cells. These effects were reversed by Compound C, an inhibitor of AMPK. In addition, NaSal/AMPK activation inhibited LPS-induced STAT3 phosphorylation, which was reversed by Compound C treatment.
【Conclusion】
AMPK activation is important for NaSal-mediated inflammation by inducing apoptosis, reducing cell proliferation, inhibiting STAT3 activity, and producing TNF-α and IL-1β.
【Keywords】sodium salicylate(NaSal); AMP-activated protein kinase (AMPK); lipopolysaccharide (LPS); apoptosis;proliferation;cytokine; signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
正文
前言
AMPK是由一个α催化亚基和两个β、γ调节亚基构成的细胞能量状态关键调节器[1, 2][3]。AMPK激活后主要通过促进脂肪酸氧化、利用分解代谢和抑制有氧糖酵解保存ATP。活化的免疫细胞和增殖中的细胞(包括肿瘤细胞)多进行有氧糖酵解代谢,非活化的免疫细胞和抗炎细胞多利用脂肪酸氧化生成ATP[4],因此AMPK激活后可能发挥抗炎效应。最近研究表明炎症过程中,AMPK可使巨噬细胞从促炎表型转化为抗炎表型[5]。与炎症过程中发挥积极作用相一致,有研究者认为AMPK促进细胞凋亡、抑制细胞增殖[6]。在哺乳动物,快速增殖中的细胞多利用有氧糖酵解代谢来满足对ATP的高需求[4]。AMPK激活后通过抑制细胞生长和增殖促进ATP保存[7]。同时AMPK激活后,许多由AMPK调控的通路,如p53–p21轴激活、mTOR 通路抑制、脂肪酸氧化促进都可抑制细胞增殖[8]。凋亡可以程序性消除炎症、免疫耐受等条件下的危害细胞,同时不引起炎症应答或组织损伤[9, 10]。有研究报道AMPK高表达具有潜在促凋亡作用,AMPK激活剂、持续性激活AMPK的突变体均可实现[11, 12]。这些表明AMPK激活药物可能对炎症相关疾病治疗有效。
水杨酸钠是阿司匹林的代谢物且广泛用于治疗炎症相关疾病[13]。普遍认为水杨酸钠药理作用机制包括抑制环氧酶、抑制NF-κB通路[14, 15]。有研究表明水杨酸钠可以直接激活AMPK,促进构象激活、苏氨酸172位点磷酸化[16]。迄今为止,水杨酸钠激活后的AMPK通路在炎症细胞中发挥的作用相关报道很少。虽然水杨酸钠在炎症环境下具有抗增殖、促凋亡的作用[17, 18],但其确切机制仍然不清楚。本实验拟在研究水杨酸钠的抗炎效应是否部分依赖于AMPK通路,以及水杨酸钠如何调节LPS刺激后的THP-1细胞炎症反应。单核细胞是免疫系统的重要组成部分,在机体脓毒症时发挥关键作用。人单核细胞对LPS刺激反应敏感,通过表达炎症因子等途径调节LPS刺激后的固有免疫应答[19]。THP-1细胞广泛应用于研究单核细胞免疫反应能力的模型中。本实验利用LPS刺激的人单核细胞THP-1体外培养模型,研究AMPK在水杨酸钠调节的炎症反应中发挥的作用。
 
材料和方法
一、实验材料
THP-1细胞系购自武汉大学细胞库,采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,在5%CO2饱和湿度、37℃培养箱中悬浮培养,2~3天换液1次,取对数生长期细胞进行实验。
二、主要仪器、试剂及配方
1. 主要仪器设备
高压蒸汽灭菌器(MLS-3780)日本Sanyo公司
Milli-Q 超纯水系列美国Millipore 公司
4℃冰箱日本Sanyo 公司
SIM-F140制冰机日本Sanyo公司
BCD-215TBDZ低温-20℃冰箱青岛海尔股份有限公司
FACScan流式细胞仪美国BD公司
-80℃深低温冰箱日本Sanyo 公司
恒温水温箱上海跃进医疗器械厂
TG-16W台式高速离心机长沙湘智离心机仪器公司
SW-CF-2FD型医用超净台苏州安泰空气技术有限公司
Centrifuge 5415R型台式低温高速离心机德国Eppendorf公司
低速离心机北京医用离心机厂妙奇
手压塑料封接机温州市鹿城区南浦丰奇包装机械厂AR2104型电子分析天平美国OHAUS公司WH-3微型漩涡混合仪上海沪西分析仪器厂有限公司磁力加热搅拌器常州国华电器有限公司
Eppendorf移液器德国 Eppendorf 公司Western-blot凝胶电泳仪美国Bio-Rad公司
Western-blot凝胶转移槽美国Bio-Rad公司
Image Lab显色曝光仪美国Bio-Rad公司
细胞培养箱美国Thermo公司
细胞培养瓶美国corning 公司
细胞培养板武汉博士德公司
15mL、50mL离心管武汉博士德公司
0.22µm微孔滤膜器德国Merck Millipore公司
2. 主要试剂
脂多糖Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5        美国Sigma公司
水杨酸钠Sodium salicylate                       美国Sigma公司
AICAR美国Sigma公司
Compound C                                            美国Selleck公司
1640培养基美国Gibco公司
胎牛血清FBS                                            美国Gibco公司
人Phospho-AMPKα (Thr172) Rabbit mAb一抗美国Cell Signaling公司
人AMPKαRabbit mAb一抗美国Cell Signaling公司
人p-STAT3(Tyr705) Rabbit mAb一抗美国Cell Signaling公司
人STAT3 Rabbit mAb一抗美国Cell Signaling公司
人Bcl-2 Rabbit mAb一抗美国Cell Signaling公司
人PCNARabbit mAb一抗美国Cell Signaling公司
人β-actin Mouse mAb一抗武汉博士德公司
羊抗鼠HRP二抗美国Abbkine公司
羊抗兔HRP二抗美国Abbkine公司
BCA蛋白质定量试剂盒武汉博士德公司
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液5x                             武汉博士得公司
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒武汉博士得公司
Prestained Protein Ladder预染蛋白Marker           美国Thermo Scientific公司
Western超敏ECL显色液美国Thermo Scientific公司
WesternBright ECL显色液武汉聚能译通公司
牛血清白蛋白(BSA)武汉科瑞公司
PMSF (苯甲基磺酰氟)                                      武汉科瑞公司
广谱蛋白酶抑制剂混合物武汉博士德公司
广谱磷酸酶抑制剂混合物武汉博士德公司
Cell Extraction Buffer细胞裂解液美国Invitrogen公司
Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒美国BD公司
Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits              美国Invitrogen公司
Human IL-6 ELISA Kit                                    上海依科赛公司
Human IL-1β ELISA Kit                                   上海依科赛公司
Human TNF-alpha ELISA Kit                     美国R&D公司
二甲基亚砜DMSO                                       美国Sigma公司
无菌PBS溶液武汉科瑞公司
3. 主要配方
完全培养基:FBS加入到RPMI-1640培养基中配成10%FBS完全培养基,混匀后4℃储存备用。
电泳缓冲液:Tris(MW121.14) 3.03 g,甘氨酸(MW75.07) 18.77 g,0.1% SDS 1 g,加蒸馏水定容至1000 mL,搅拌混匀,溶解后室温保存待用。
转移缓冲液液: Tris 5.8 g(MW121.14),甘氨酸(MW75.07) 2.9 g, SDS 0.37 g,甲醇 200 mL,加蒸馏水定容至1000 mL,搅拌混匀,溶解后室温保存待用。
1×TBS缓冲液:Tris-Base1.211g, NaCl 8.8g,HCl 0.64ml,加蒸馏水定容至1000 mL,搅拌混匀,溶解后室温保存待用。
10×TBS缓冲液:Tris-Base12.116g, NaCl 88g,HCl 6.4ml,加蒸馏水定容至1000 mL,搅拌混匀,溶解后室温保存待用。
TBST溶液:Tween20 1000ul,TBS1000ml,混匀,室温保存待用。
5%BSA封闭液:BSA 5g,TBST 100ml,用前配制,混匀待用,可重复用1-3次。
分离胶及浓缩胶配方:
试剂 10%分离胶 5%浓缩胶
蒸馏水 4ml 3ml
30%Acr-Bis(29:1) 3.3ml 0.75ml
1M Tris, pH8.8 0.75ml
1.5M Tris-HCl(pH6.8) 2.5ml
10% SDS 100ul 60ul
10% 过硫酸铵AP 100ul 45ul
TEMED 4ul 6ul
三、实验方法
1. Western blotting 检测蛋白表达水平
(1)细胞种板及加药:将对数生长期THP-1细胞配制成7x105 cell/ml的细胞悬液,每孔2ml加入6孔细胞培养板内,放入细胞培养箱中静置过夜,第二天取出6孔板,按实验分组加药,混匀5min,放入细胞培养箱中培养24h。
(2)收集细胞:分组收集6孔板内细胞,将细胞悬液收集于EP管,8000rpm 4℃离心5min,弃上清,加1ml冰PBS溶液洗两遍,弃上清。
(3)裂解细胞:每个EP管加入150µl现配的Western Blot裂解液(含1%PMSF,1%广谱蛋白酶抑制剂混合物,1%广谱磷酸酶抑制剂混合物),吹打混匀,放于冰上30分钟,每10分钟涡旋混匀一次,然后13000rpm 4℃离心10分钟,吸取蛋白上清于另一新EP管中。
(4)检测蛋白浓度:取5µl样品加20µl PBS溶液稀释5倍后,用BCA蛋白检测试剂盒检测样品各组蛋白浓度,根据所测浓度用Western Blot裂解液将所有组蛋白浓度调整一致。
(5)蛋白变性:每个EP管中加入适量蛋白上样缓冲液(样品:蛋白上样缓冲液比例为4:1),混匀,离心,放入100℃水浴锅内煮10min,放入-20℃冰箱保存待用。
(6)制胶及蛋白上样:
1、准备好洗净、烤干的玻璃板和梳子,制胶架下架放好胶垫,保证玻璃板底部水平对齐后卡紧玻璃夹。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
2、按前面方法配制10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀、马上灌胶。灌胶时,1ml枪头吸取配好的溶液沿玻璃板右上角慢慢加入分离胶溶液,待胶面升至薄玻璃板上边缘下方2cm左右高度即可,保证分离胶溶液液面平整。然后用200ul中枪头吸取三蒸水、从左至右操作,灌液液封玻璃板,直至薄玻璃板上边缘。(灌胶时可放慢速度,保证胶液面水平不歪斜;操作时确保胶一定沿着玻璃板流下,避免气泡产生;加水液封时要平行流下,避免分离胶上缘冲变形)。
3、当水、胶之间有一条折射线出现时,说明胶已凝。再等待约10min使胶充分凝固,然后倒去胶上层三蒸水,并竖直放立胶架,用干净的白色滤纸吸进残留三蒸水。
4、按前面配方配制5%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀、马上灌胶。将剩余空间用中号枪头灌满浓缩胶,然后即刻将梳子插入浓缩胶中,灌胶时避免胶体间产生气泡,插梳子时保证梳子水平。等待约20~30min使胶充分凝固。
5、将凝好的胶连同玻璃板小心放入电泳槽中。薄玻璃板面向内,厚玻璃板面向外。
6、将玻璃板间灌满电泳液,拂去上方气泡。取出蛋白样品和蛋白Marker,蛋白样品100℃水浴锅内煮5min,混匀蛋白样品,双手水平小心拔出梳子,用20ul小枪头吸取15µl样品或2µl蛋白Marker,按分组顺序依次加入胶孔内,蛋白Marker加于两侧蛋白旁,枪头进入胶孔内后缓慢加入蛋白样品,使其全部沉淀于孔底部,进入胶孔后的枪头只出不进、避免将蛋白样品带出。
(7)跑胶:采用40V恒压电泳约1h,待彩色Marker到达分离胶并开始平行分离,改用80V恒压电泳约1.5h,待溴酚蓝接近到达胶底部时停止电泳。
(8)切胶转膜:
1、准备4块与转膜夹海绵垫同样大小、形状的滤纸,每块包含8张滤纸。根据需要准备合适宽度和长度的PVDF膜数张。戴手套剪切滤纸和PVDF膜、避免手上蛋白污染膜。将切好的PVDF膜右上角做好相应预转蛋白标记,提前置于甲醇中浸泡约5-10min,使用前放入转膜液中平衡数秒后再使用。
2、清洗干净搪瓷盘,加入适量转膜液,准备好转膜用的转膜夹、海绵垫、切角片、巴氏吸管、玻璃棒和滤纸。
3、将滤纸块和海绵垫分别用搪瓷盘内转膜液完全浸湿,并从左至右分别擀净滤纸间残留气泡、保证纸间无气泡状态,然后将海绵垫、滤纸块依次放在转膜夹上待用(夹子在下,海绵垫在中,滤纸在上)。再用玻璃棒同时擀去滤纸和海绵垫上的气泡。
4、从电泳槽中取出玻璃板,厚玻璃板放桌面侧,薄玻璃板朝上,从右上角一侧轻轻撬开薄玻璃板,用巴士吸管吸取搪瓷盘内转膜液、加少许于胶面上防止干燥。根据蛋白Marker的指示切取相应位置的胶条,切取时使两侧胶条包含蛋白Marker在内以避免样品蛋白被切掉,用小夹子从一侧取出切好胶条放在转膜夹滤纸上,用巴士吸管吸取转膜液、轻轻冲走胶条和滤纸之间的气泡,保证胶条湿润状态后将PVDF膜放在胶条上对齐覆盖,用巴氏吸管吸取转膜液轻轻冲走胶条和PVDF膜之间的气泡、保证PVDF膜湿润状态,后面的胶条重复上述步骤,确认所有胶条和PVDF滤纸间无气泡并处于湿润状态后,将上方滤纸块盖于PVDF膜上,再用玻璃棒一起赶走滤纸及下方气泡,盖上海绵垫,合起夹子(注意胶条和PVDF膜对齐后操作小心以避免两者移位;注意将相同分子大小的胶条放入相同转膜夹内,不同分子大小的胶条分开放置转膜夹)。
5、将转膜夹放入转膜槽中,保证夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。湿转时会产热,在冰槽盒内放满冰块、然后放入转膜槽内,盖上转膜盖子(注意黑色接头对应黑色接线、红色接头对应红色接线),整个转膜槽放入大冰盒内,上面用冰覆盖,设定恒流200mA,根据蛋白分子量大小,转膜时间根据蛋白分子量的大小1kD约1min,β-actin转膜时间为42 or 43 ? min,p-AMPK及AMPK转膜时间为62min,p-STAT3及STAT3转膜时间为86min,Bcl2转膜时间为26min,PCNA转膜时间为36min。
(9)封闭:提前配好含5%BSA的封闭液,转膜结朿后将PVDF膜取出(见彩色Marker条带,说明转膜成功),将膜放入封闭液中,置于摇床上,室温封闭90min。
(10)一抗孵育:根据抗体说明书,β-actin,p-AMPK及AMPK,p-STAT3及STAT3,Bcl2,PCNA抗体分别以1:500,1:1000,1:2000,1:1000,1:1000的比例用封闭液稀释、混匀,将膜和一抗稀释液封于PE手套膜中,避免套内有气泡,放入4℃冰箱孵育过夜(至少12h)。
(11)洗一抗:从冰箱中将膜取出,放在摇床上复温半小时,从PE手套中小心取出膜,用TBST液洗3次,每次5min。
(12)二抗孵育:参考二抗的说明书,将二抗按照1:10000比例用TBST液稀释、混匀,将膜和二抗稀释液封于PE手套膜中,避免套内有气泡,置于摇床上缓慢摇动、室温孵育2h。
(13)二抗洗涤:用镊子将膜取出,用TBST液洗3次,每次5min。
(14)ECL检测与分析:将超敏ECL 显色液和普通ECL显色液按照1:5的比例配制,超敏ECL显色液和普通ECL显色液配制均为 A液:B液=1:1,混合后,加至PVDF膜上,充分反应1min后,曝光显色, 用Image Lab软件分析灰度值。
2. Annexin V/PI检测细胞凋亡
(1)细胞种板及加药:将对数生长期THP-1细胞配制成7x105 cell/ml的细胞悬液,每孔1ml加入12孔细胞培养板内,放入细胞培养箱中静置过夜,第二天取出6孔板,按实验分组加药,混匀5min,放入细胞培养箱中培养24h。
(2)用三蒸水将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer。
(3)收集细胞:分组收集12孔板内细胞,将细胞悬液收集于EP管,8000rpm 4℃离心5min,弃上清,加1ml冰PBS溶液洗两遍,弃上清。
(4)每个EP管加入120ul 1x Binding Buffer,将细胞吹打混匀、操作轻柔,然后各取100ul悬液于流式管。
(5)分别向每个流式管中加入5ul FITC Annexin V和 5ul PI,混匀,避光操作。然后在室温(25℃)下避光孵育15min。
(6)每个流式管加入400ul 1x Binding Buffer,轻轻混匀,尽早用FACScan流式细胞仪检测。
3.EdU检测细胞增殖
(1)实验前1天提前试剂准备
1.让试剂恢复至室温再打开
2.准备10mM的EdU:加入4ml DMSO到EdU中,负20℃保存、1年内有效。
3. 准备1×破膜剂/洗液:试剂盒组分E以1:10用含1% BSA的PBS溶液稀释,4℃保存,使用剩余的1×破膜剂/洗液放入4℃冰箱可保存6个月。
4. 准备10×EdU反应缓冲液添加剂:2ml三蒸水加到试剂盒组分G中,负20℃可保存一年。
(2)细胞种板及加药:将对数生长期THP-1细胞配制成7x105 cell/ml的细胞悬液,每孔1ml加入12孔细胞培养板内,放入细胞培养箱中静置过夜,第二天取出6孔板,按实验分组加药,混匀5min,放入细胞培养箱中培养24h。
(3)标记EdU:
1.细胞培养至21h时取出12孔板,各组分别加入10ul的EdU、混匀3min后孵育3h,终浓度为10μM。阴性对照组不加EdU。
(4)收集细胞:分组收集12孔板内细胞,将细胞悬液收集于EP管,5000rpm离心5min,弃上清。
(5)固定破膜
1. 每个EP管中加入含 1%BSA的PBS溶液,洗细胞1次,即5000rpm离心5min,弃上清。
2. 每个EP管中加入50ul固定液(试剂盒组分D)重悬,室温15min,避光。
3. 每个EP管中加入含 1%BSA的PBS溶液,再洗细胞1次,即5000rpm离心5min,弃上清。
4. 每个EP管中加入配制好的1×破膜剂/洗液100ul,重悬,孵育15min。
(6)反应
1. 准备1×EdU反应缓冲液添加剂:根据实验需求配制适量1×EdU反应缓冲液添加剂,用三蒸水稀释10×EdU反应缓冲液添加剂。
2. 按照下表准备反应体系溶液,根据实验需求配制相应体积:
 
反应组分 反应检测数
2 4 10 20 30
PBS溶液 438ul 876ul 2.19ml 4.38ml 6.57ml
Copper protectant
(组分F) 10ul 20ul 50ul 100ul 150ul
荧光染料叠氮甲基吡啶 2.5ul 5ul 12.5ul 25ul 37.5ul
1×EdU反应缓冲液添加剂 50ul 100ul 250ul 500ul 750ul
总反应体系 500ul 1ml 2.5ml 5ml 7.5ml
(注意:临用前15min内准备反应体系)
3.向每个EP管中加入250ul配置好的反应体系溶液,混匀,避光孵育30min。
4. 收集细胞团块,5000rpm离心5min,弃上清。
5.向EP管中加入1ml的1×破膜剂/洗液洗细胞2次,每次5000rpm离心5min。
6.向离心后的细胞团块中分别加入250ulPBS,吹打混匀后尽早用FACScan流式细胞仪检测。
4. ELISA法检测细胞因子含量
(1)细胞种板及加药:将对数生长期THP-1细胞配制成7x105 cell/ml的细胞悬液,每孔2ml加入6孔细胞培养板内,放入细胞培养箱中静置过夜,第二天取出6孔板,按实验分组加药,混匀5min,放入细胞培养箱中培养24h。
(2)收集细胞上清液:将细胞上清液转移入EP管中,8000rpm离心6min,吸取上清转移至一个新的EP管中,放于-80℃冰箱保存待用。
(3)检测细胞因子的浓度:取出细胞因子检测试剂盒和待测样品,按说明书步骤检测样品细胞因子浓度,绘制标准曲线,计算细胞因子含量。
5.统计分析
采用SPSS13.0软件进行统计学处理,实验结果以均数±标准误表示,两组间差异性比较采用非配对性t验,p<0.05为差异具有统计学意义。
 
实验结果
1.NaSal对 LPS刺激的THP-1细胞磷酸化AMPK(p-AMPK)蛋白表达水平的影响。
THP-1细胞加入NaSal和/或LPS体外培养后,应用Western blot方法检测细胞p-AMPK磷酸化蛋白及AMPK总蛋白表达,并计算各组pAMPK/AMPK相对表达量。如图1A.B所示,NaSal可上调AMPK蛋白磷酸化水平,LPS刺激后的THP-1细胞p-AMPK蛋白水平与正常对照组相比降低,NaSal可完全逆转LPS刺激后p-AMPK蛋白表达降低。AMPK总蛋白表达各组之间无明显差异。
 
图1 NaSal对LPS刺激的THP-1细胞p-AMPK及AMPK蛋白表达水平的影响。(n=3)THP-1细胞加LPS 和/或NaSal处理,孵育后收集细胞,采用western blot方法检测p-AMPK磷酸化蛋白及AMPK总蛋白表达,pAMPK/AMPK为各组p-AMPK相对表达量。(结果以均数±标准差表示,n>3,*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001 vs Control; #P<0.05、##P<0.01、###P<0.001 vs LPS 10ug/ml)
2. NaSal对 LPS刺激的THP-1细胞凋亡和增殖的影响。
既往研究显示,NaSal和阿司匹林促进结直肠癌细胞[20]、B慢淋巴白细胞(B-CLL)[21]、血管平滑肌细胞[22]、人胰腺癌细胞[18]的凋亡,抑制其增殖。本研究用LPS刺激THP-1细胞并以NaSal处理。用Annexin V/PI染色检测细胞凋亡,用EdU标记检测细胞增殖。如图2A显示,NaSal诱导LPS刺激后THP-1细胞凋亡显著增加;LPS组与LPS+NaSal组比较,细胞凋亡发生率(图2 A.B)。如图2C所示,NaSal抑制LPS刺激后THP-1细胞增殖反应;LPS+NaSal组与LPS组比较,细胞EdU的结合比率由 (P<0.01,图2D)。
 
图2 NaSal对LPS刺激的THP-1细胞凋亡和增殖的影响。THP-1细胞加LPS 和/或NaSal处理,孵育24h后收集细胞,运用细胞流式分析仪分别通过Annexin V/PI染色和EdU标记检测细胞凋亡和细胞增殖。(结果以均数±标准差表示,n=3-5,*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001,vs Control; #P<0.05、##P<0.01、###P<0.001 vs LPS 10ug/ml)
3.AICAR对 LPS刺激的THP-1细胞磷酸化AMPK(p-AMPK)蛋白表达水平、细胞凋亡和细胞增殖的影响。
为了进一步验证NaSal对LPS刺激的THP-1细胞凋亡和增殖的影响是否依赖于AMPK蛋白的激活,本研究使用了AMPK特异性激动剂AICAR[23]。THP-1细胞加LPS 和/或AICAR处理,培养24h后应用Western blot方法检测细胞p-AMPK磷酸化蛋白及AMPK总蛋白表达,并计算各组pAMPK/AMPK相对表达量。如图3 A.B所示,LPS刺激的THP-1细胞p-AMPK蛋白表达水平与正常对照组相比降低。LPS+AICAR组与LPS组相比较,AICAR加入后上调了LPS刺激的THP-1细胞p-AMPK蛋白表达水平、AICAR可完全逆转LPS刺激后p-AMPK蛋白表达降低,AMPK总蛋白表达各组之间无明显差异。利用流式细胞检测仪分别通过Annexin V/PI染色和EdU标记染色检测细胞凋亡和细胞增殖。与NaSal相似,AICAR明显诱导 LPS刺激的THP-1细胞发生凋亡,LPS组与LPS+AICAR组比较,THP-1细胞凋亡发生率从(P<0.001; Fig. 3C,D);AICAR抑制LPS刺激的THP-1细胞发生增殖,LPS+AICAR组与LPS组比较,细胞的EdU结合比率(P<0.001; 图 3E,F)。
 
图3 AICAR对 LPS刺激的THP-1细胞磷酸化AMPK(p-AMPK)蛋白表达水平、细胞凋亡、细胞增殖的影响。THP-1细胞加LPS 和/或AICAR处理,孵育h后收集细胞,采用western blot方法检测p-AMPK磷酸化蛋白及AMPK总蛋白表达,pAMPK/AMPK为各组p-AMPK相对表达量。运用细胞流式分析仪分别通过Annexin V/PI染色和anti-EdU Alexa Fluor 488染色检测细胞凋亡(C)和细胞增殖(E)。(结果以均数±标准差表示,n>3,*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001 vs Control; #P<0.05,#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001 vs LPS 10ug/ml)
4.CC对NaSal处理的、LPS刺激下的THP-1细胞凋亡和增殖的影响
NaSal处理LPS刺激的THP-1细胞,使用AMPK抑制剂CC抑制细胞AMPK活性。如图4B所示,LPS+NaSal+CC组与LPS+NaSal组相比,p-AMPK表达降低、提前1h加入CC (1μM)可以抑制LPS+NaSal组p-AMPK表达增加。应用Western blot方法检测细胞增殖标志物PCNA蛋白和抗凋亡标志物Bcl-2蛋白的表达,并计算各组PCNA/β-actin和Bcl-2/β-actin相对表达量。如图4C所示,LPS+NaSal组与LPS组相比,Bcl-2蛋白和PCNA蛋白表达降低;LPS+NaSal+CC组与LPS+NaSal组相比,Bcl-2蛋白和PCNA蛋白表达增加、提前加入CC (1μM)可以抑制LPS+NaSal组Bcl-2蛋白和PCNA蛋白表达降低(图 4D,E)。
 
图4.CC对NaSal处理的、LPS刺激下的THP-1细胞凋亡和增殖的影响。CC预处理THP-1细胞后加µg/ml LPS 和/或mM NaSal,孵育h后收集细胞,用Western blot方法检测细胞p-AMPK蛋白、Bcl-2蛋白、PCNA蛋白、β-actin蛋白及AMPK总蛋白表达,并计算各组pAMPK/AMPK、Bcl-2/β-actin 及PCNA/β-actin相对表达量。(A,B)p-AMPK、AMPK蛋白表达,各组p-AMPK相对表达量(p-AMPK/ AMPK),(C,D,E) Bcl-2蛋白、PCNA蛋白和β-actin蛋白表达,各组Bcl-2蛋白、PCNA蛋白相对表达量(Bcl-2/β-actin ,PCNA/β-actin)。(结果以均数±标准差表示,n>3, *P<0.05、***P<0.001 vs control;#P<0.05、 ###P<0.001 vs LPS 10ug/ml;&P<0.05 、&&&P<0.05 vs LPS10ug/ml+NaSal5mM)
5.CC对NaSal处理的、 LPS刺激下的THP-1细胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的影响
应用ELISA方法检测NaSal处理的、LPS刺激下的THP-1细胞促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。如图5 B.C所示,NaSal进一步促进LPS刺激的THP-1细胞TNF-α、IL-1β的分泌。LPS+NaSal+CC组与LPS+NaSal组相比,TNF-α和IL-1β分泌增加,提前加入CC (1μM)可以抑制LPS+NaSal组TNF-α和IL-1β分泌增加。NaSal可抑制LPS刺激的THP-1细胞IL-6分泌增加,加入CC后不能改变NaSal的抑制作用 (图 5A)。数据表明,NaSal对LPS刺激的THP-1细胞TNF-α和IL-1β的分泌调节机制包括AMPK激活。
 
图5 CC对NaSal处理的、LPS刺激下的THP-1细胞IL-6、TNF-α和IL-1β分泌的影响。CC预处理THP-1细胞1h后加µg/ml LPS 和/或mM NaSal,孵育h后收集细胞,用ELISA方法检测细胞上清IL-6 (A)、TNF-α(B)和IL-1β(C)分泌量。(结果以均数±标准差表示,n=3, ***P<0.001 vs control;##P<0.05、 ###P<0.001 vs LPS 10ug/ml;&&&P<0.001 vs LPS10ug/ml+NaSal5mM)
6.NaSal/AMPK激活抑制STAT3活性
因为NaSal与AMPK直接结合,STAT3在细胞炎症、凋亡、生存、增殖与生长过程中发挥重要作用[24, 25],我们进一步检测NaSal激活的AMPK是否调节STAT3活性。应用Western blot方法检测细胞p-STAT3磷酸化蛋白及STAT3总蛋白表达,并计算各组p-STAT3/STAT3相对表达量。如图6A.B所示,与对照组相比,LPS刺激的THP-1细胞p-STAT3表达明显增加。加入NaSal后THP-1细胞p-STAT3蛋白表达显著降低,提前加入CC(1μM)后可以有效逆转p-STAT3蛋白表达下降。STAT3总蛋白表达各组之间无明显差异。与NaSal一致,AMPK激动剂AICAR对LPS刺激的THP-1细胞p-STAT3蛋白表达有抑制效应(图6C, D)。
 
图6 NaSal/AMPK激活对 LPS刺激的THP-1细胞STAT3磷酸化的影响。CC预处理THP-1细胞h后加µg/ml LPS 和/或NaSal/mM AICAR,孵育h后收集细胞,运用Western blot方法检测细胞p-AMPK、p-STAT3磷酸化蛋白及AMPK、STAT3总蛋白表达,并计算各组pAMPK/AMPK、p-STAT3/STAT3相对表达量。(A,C)p-STAT3、STAT3蛋白表达。(B,D)各组 p-STAT3相对表达量(p-STAT3/STAT3)。(结果以均数±标准差表示,n>3, ***P<0.001 vs control;##P<0.05、 ###P<0.001 vs LPS 10ug/ml;&&P<0.001 vs LPS10ug/ml+NaSal5mM)
讨论
水杨酸用于镇痛、解热、抗炎、减少胰岛素抵抗和癌症等治疗。最近研究提示,水杨酸作用机制可能不仅与环氧化酶、NF-κB通路抑制有关,部分可能与AMPK激活调节[15]相关。AMPK几乎存在于所有真核细胞,是高度保守的细胞能量状态调节器[26]。能量应激时,AMPK通过直接作用或与其他信号通路相互作用抑制细胞生长、生物合成过程。AMPK激活可以调控许多过程,包括细胞生长、自噬、凋亡、炎症代谢等。本研究的目的之一是评估在水杨酸钠处理的、LPS刺激的THP-1细胞炎症反应中,AMPK的参与程度。细胞凋亡和增殖在炎症和炎症相关疾病进程中都发挥着重要作用。有研究显示在LPS诱导的大鼠休克模型中,凋亡细胞可以通过减少促炎因子产生、抑制中性粒细胞浸润、减少血清LPS水平等机制保护大鼠对抗休克[27]。我们的流式分析和western blot检测结果显示,水杨酸钠诱导细胞凋亡、抑制增殖、下调细胞增殖标志物PCNA蛋白和抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达,并且水杨酸钠作用效应可以部分被AMPK抑制剂CC逆转。我们的研究结果发现在LPS刺激的THP-1单核细胞中,水杨酸钠抑制LPS诱导的AMPK去磷酸化、促进细胞凋亡、抑制增殖,运用特异AMPK激动剂AICAR作用结果相似。我们的研究表明在LPS刺激的THP-1单核细胞中,水杨酸钠凋亡诱导和增殖抑制作用依赖于AMPK激活。实验结果与最近的研究相一致,研究显示代谢应激时AMPK是凋亡诱导物和增殖抑制剂,AMPK激活诱导细胞凋亡、减少增殖[6, 11]。在人体肝癌细胞[23]、HT-29结肠癌细胞[6]、膀胱癌T24细胞[28],AMPK 激活均抑制细胞增殖生长、诱导细胞凋亡。然而,有报道认为AMPK是抗凋亡分子、AMPK激活后抑制细胞凋亡可以预防疾病相关细胞功能障碍发生[29]。因此,AMPK激活诱导细胞凋亡、抑制增殖的效应可能取决于不同的细胞类型和实验条件。
研究提示,AMPK对炎症发挥抑制作用[30]。AMPK激活抑制LPS刺激的巨噬细胞[31]、BV2 小胶质细胞[32]和系膜细胞[33]促炎细胞因子表达。然后,最近有研究也发现AMPK激活通过增加细胞因子如IL-1β、IL-6的释放发挥AMPK促炎效应[34, 35]。AMPK激活后炎症因子的表达差异可能是因为在不同的细胞类型中AMPK发挥不同的生物效应。单核细胞是免疫系统重要组成部分,LPS刺激时、单核细胞可通过表达炎症相关因子(IL-1b、IL-6、IL-8、IL-10 和TNF-α)进行应答[36]。因此,我们首先检测水杨酸钠在LPS刺激的THP-1单核细胞中发挥的作用,发现水杨酸钠促进LPS刺激的THP-1单核细胞TNF-α、IL-1β分泌、抑制IL-6分泌。为了证实在水杨酸钠处理的、LPS刺激下的THP-1细胞中,AMPK激活参与调节炎症相关因子分泌,我们运用CC阻断AMPK活性、发现水杨酸钠诱导TNF-α 和IL-1β分泌增加依赖于AMPK激活、但是水杨酸钠对IL-6的分泌抑制不依赖于AMPK。水杨酸钠激活的AMPK通过增加TNF-α 、IL-1β的分泌对LPS刺激的THP-1细胞也发挥着促炎效应。最近研究报道在许多脓毒症实验模型中,水杨酸钠通过触发脂氧素、阻止脓毒症微生物介质、减少NF-κB刺激、抑制脓毒症通路发挥有益效应[37]。不同的作用机制可以解释在非甾体类抗炎药干预的不同模型中得出的不同实验结论,同时后期研究需要进一步探寻AMPK在水杨酸钠调节的脓毒症反应中发挥的作用。
STAT3在许多下游基因的调控中发挥重要作用,这些基因控制应激反应、免疫、炎症、癌症转移等。STAT3通过调节细胞增殖、诱导抗凋亡基因如Bcl-2和Bcl-xl表达参与炎症相关疾病[20, 38]。然而,在水杨酸钠处理的炎症反应中,STAT3与AMPK的相关性尚不清楚。在本实验中,AMPK激动剂水杨酸钠、AICAR处理LPS刺激的THP-1细胞,同时应用AMPK抑制剂CC抑制AMPK活性,我们发现AMPK激活伴随着STAT3活性抑制、应用CC可以阻止STAT3活性抑制并且使其逆转为激活状态。因此我们推测,水杨酸钠激活AMPK后抑制STAT3通路活性。有研究显示,二甲双胍激活AMPK后抑制STAT3通路活性从而抑制体内、体外模型中肝癌细胞生长[23]。另一个研究发现,二甲双胍作为AMPK的激动剂、通过抑制STAT3-Bcl2通路活性抑制食管鳞状细胞癌生长[39]。然而在我们的研究中,AMPK-STAT3轴是否参与到水杨酸钠调节的细胞凋亡、增殖、炎症因子分泌效应尚未明确,拟在后面的实验中进一步研究。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
结论
本实验结果表明在LPS刺激的THP-1单核细胞,AMPK激活通过诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、增加TNF-α和IL-1β分泌参与了水杨酸钠调节的炎症反应。此外,我们的实验首次证实了水杨酸钠的抗炎效应部分通过AMPK激活实现,AMPK在炎症及炎症相关疾病中发挥的作用值得进一步探讨。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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综述
AMPK与炎症相关疾病研究进展
包娓娓,梅伟
同济医学院附属同济医院麻醉科,武汉,湖北,430030
【摘要】腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)广泛存在于真核细胞内,是细胞能量状态关键调节器,通过维持ATP产出和消耗的平衡调节细胞代谢。炎症是机体的防御机制,慢性炎症或炎症过度则会引起细胞死亡、组织损伤、器官恶化等。创伤、休克、感染、脓毒症等病因导致的系统性炎症和机体局部炎症均会导致器官功能损害。炎症是许多疾病的病理基础,例如:神经退行性疾病、血脑屏障破坏、全脑缺血、动脉粥样硬化、急性肺损伤(ALI)。最近研究表明,激活AMPK可以通过减少促炎因子及炎症相关因子表达、抑制NF-κB核转位、维持组织形态完整性等途径控制炎症从而减少脑组织、肺组织损伤,减少动脉粥样硬化发生。因此, AMPK 及其信号通路有望成为抗炎治疗新靶点。本文就 AMPK与机体炎症相关疾病的关系进行综述。
【关键词】腺苷酸活化蛋白激酶;炎症;神经退行性疾病;血脑屏障;全脑缺血;动脉粥样硬化;急性肺损伤
Recent advances in the study of AMPK and inflammation-related
diseases
Abstract:AMP-activated protein kinase (AMPK),an energy status sensor in all eukaryotic cells , regulates cellular metabolism by maintaining the balance between ATP production and consumption. Inflammation protects organism against damage, but it can lead to cellular death, tissue damage and organ deterioration if it is converted to a chronic state or it becomes overwhelming. The common pathologicalbasis for neurodegeneration diseases, disruption of the blood–brain barrier (BBB), global cerebral ischemia, atherosclerosis, and acute lung injury (ALI) is inflammation. Recent studies demonstrated that AMPK activation alleviated brain injury, lung damage and atherosclerosis by controlling inflammation responses through reducing pro-inflammatory cytokines and inflammation-related factors, prohibiting NF-κB nuclear translocation and improving morphologic features of injury tissues. Thus, AMPK pathway might become a novel target for anti-inflammatory therapy.This review summarized the relationship between AMPK and the development and treatment of inflammation-related diseases.
Key words:AMPK;inflammation;neurodegeneration disease;BBB;global cerebral ischemia;atherosclerosis;ALI
AMPK是参与细胞能量代谢调节的关键激酶,调控细胞和整个机体的能量代谢平衡。AMPK激活后抑制合成代谢、促进分解代谢过程,从而保存ATP。同时,AMPK可通过调节细胞循环过程、神经元细胞膜兴奋性来保存ATP[1]。近年来一些研究提示,常用药物如:水杨酸(阿司匹林代谢产物)、二甲双胍至少部分通过激活AMPK发挥药理作用。组织损伤、感染、肿瘤发生等病理过程均会引起炎症反应。近年来,AMPK对机体病理过程、疾病炎症反应的调控受到关注。研究显示,AMPK激活后通过抑制糖酵解、促进氧化磷酸化,改变炎症细胞抗炎表型,调控免疫重要信号通路等途径抑制炎症。因此,AMPK有望成为炎症相关疾病控制的新药理学靶点。本文根据最近的研究就AMPK与疾病的关系做一综述。
1. AMPK与炎症
1.1AMPK简介
AMPK广泛存在于真核细胞,是由一个α催化亚基和两个β、γ调节亚基构成的丝氨酸/苏氨酸激酶。在哺乳动物,三种亚基有多种亚型(α1, α2; β1, β2; γ1, γ2, and γ3),分别由不同基因编码后组成多种异源三聚体[2]。AMPK不仅是能量感受器,同时促进组织、机体对代谢状态生理信号做出特异性应答,AMPK可以感受不同细胞、组织的生理性和病理性刺激。ATP消耗(AMP/ATP比例增加),相关刺激(运动、饥饿、低氧、细胞pH值、氧化还原、肌酸/磷酸肌酸比例增加),特定药物、激素均可激活AMPK[3]。
1.2AMPK的炎症调节效应
固有免疫、适应免疫是机体两大防御系统,可激发炎症反应抵抗病原体侵入、保护机体,同时可以修复组织损伤、改变免疫系统免受有害细胞损伤。炎症是重要的保护机制,但炎症过度或转化为慢性状态时则会危害组织、机体。炎症反应中,激活的免疫细胞如:激活的巨噬细胞、Th17细胞多进行有氧糖酵解代谢,而非激活的、抗炎表型的免疫细胞如M2巨噬细胞、调控T细胞、静止记忆T细胞多进行氧化磷酸化代谢。AMPK激活后可以通过下调糖酵解、增强氧化磷酸化过程发挥抗炎效应[4]。研究显示,AMPK激活后可调控关键炎症蛋白NLRP3炎性小体, NLRP3炎性小体激活后促进炎症因子IL-1β的表达,而IL-1β是痛风、动脉粥样硬化、肥胖等代谢紊乱的重要特征[5]。目前研究显示,AICAR、二甲双胍、2-脱氧葡萄糖、黄连素、A-769662等AMPK激动剂在许多不同模型里,均可抑制炎症反应且机制至少部分依赖于AMPK的磷酸化。
2. AMPK与机体炎症过程
2.1AMPK与脑
小胶质细胞是存在于中枢神经系统的淋系细胞。作为神经元的保护者,小胶质细胞对微环境变化反应敏感,免疫刺激、毒素、损伤等均可激活小胶质细胞应答。激活后的小胶质细胞可以释放一系列促炎因子和细胞毒素因子,从而恶化神经退行性疾病。近期研究发现[6],LPS刺激小鼠小胶质细胞BV2,细胞促炎因子IL-6和TNF-α、NO和iNOS、环氧合酶2和前列腺素E2表达增加,NF-κB核转位增加,AMPK磷酸化表达降低。ENERGI-F704 激活AMPK后可减弱上述炎性物质表达、抑制NF-κB核转位,应用AMPK抑制剂CC抑制ENERGI-F704的AMPK磷酸化表达后,ENERGI-F704的抗炎效应消失。
血脑屏障可以屏蔽大脑外的神经毒性物质,促进血、脑之间交换营养物质和废物,从而为神经细胞提供最佳胞外环境。感染、脓毒症等炎症病理过程可破坏血脑屏障完整性,增加神经毒性物质、病原微生物穿透屏障,损伤中枢神经系统。Zhao[7]等研究显示,在LPS刺激的人脑微血管内皮细胞体外模型中,AMPK激活后可以减弱LPS诱导的血脑屏障完整性和导致功能破坏(或者去掉破坏)。炎性刺激LPS破坏血脑屏障完整性、减少血脑屏障完整性依赖紧密结合蛋白如:闭合蛋白、封闭蛋白-5的表达、增加内皮细胞完整性破坏物质ROS的表达,AMPK激动剂AICAR和AMPK过表达激活AMPK后均可阻滞LPS诱导的闭合蛋白、封闭蛋白-5表达减少和ROS表达增加,从而保护血脑屏障完整性和功能。
AMPK与代谢应激密切相关,而大脑在机体器官中代谢速率快,对氧、糖供应变化敏感。深入了解AMPK在脑代谢中的作用具有重要意义。Culmsee[8]等研究显示,AMPK表达对发育期大鼠大脑有重要作用,与成年大鼠大脑相比较,AMPK催化亚基(α1 和α2)和非催化亚基(β2 和γ1)在大鼠胚胎海马神经元高表达。激活AMPK可以减少氧糖剥夺时大鼠海马神经元死亡,抑制AMPK催化亚基α1 和α2的表达,则增加氧糖剥夺时大鼠海马神经元死亡率。研究提示,在神经衰弱疾病炎症过程中,AMPK可表达保护神经元、减少有害代谢变化对神经元造成的损伤。
临床上,心脏骤停、休克、窒息的病人均可能发生全脑缺血,近年来的研究[9]提示,AMPK激动剂二甲双胍可能通过诱导AMPK磷酸化调节大鼠短暂性全脑缺血时的炎症反应和抗氧化途径,从而保护脑细胞。NF-κB、TNF-α、COX-2是炎症反应途径里的重要蛋白,激活AMPK后可以减少全脑缺血大鼠海马组织NF-κB p65、TNF-α、COX-2的蛋白表达,AMPK抑制剂抑制二甲双胍AMPK激活后可再次增加三大炎症重要蛋白分子的表达。
因此,通过这些研究,AMPK激活有可能成为治疗神经退行性疾病、保护脑功能的有效靶点。
2.2AMPK与心血管
动脉粥样硬化是冠状动脉慢性炎症的重要病理标志,血管平滑肌细胞(VSMCs)在动脉粥样硬化的形成中扮演重要角色,在动脉粥样硬化进程中,细胞因子、趋化因子刺激后的VSMCs加速炎症反应,迁移至损伤的内皮细胞。AMPK激活后通过下调TNF iNOS、COX2表达,抑制NF-κB活性,上调同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)的表达抑制TNF-α诱导的VSMCs炎症。PTEN是炎症的负性调节物,可能位于AMPK下游,AMPK激活后可能通过AMPK-PTEN途径控制VSMCs的炎症反应[10]。单核细胞诱导后可迁移、粘附、分化成成熟的巨噬细胞,这种巨噬细胞高度噬菌、消耗脂质、可转化为炎症泡沫细胞,泡沫细胞与动脉粥样硬化的形成密切相关,Krasner[11]的研究显示药物利拉普肽通过激活AMPK抑制TNF-α、LPS诱导的单核细胞粘附,从而在早期阻断动脉粥样硬化的发生。因此,通过药物干预AMPK活性可能成为预防、治疗冠状动脉粥样硬化的新靶点。
2.3AMPK与肺
    ALI是由肺炎、脓毒症、休克、胰腺炎、胃食管反流等病因导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮损伤,临床病理包括血管渗透性增加、炎症、应激、凋亡、肺水肿、中性粒细胞聚集与死亡,其发展至严重阶段被称为急性呼吸窘迫综合征。近几年,AMPK对ALI的调控受到关注。中性粒细胞在ALI中扮演着重要作用,Zhao[12]等研究显示,激活AMPK可以抑制LPS刺激后中性细胞促炎因子TNF-α和IL-6分泌、IκBα降解、NF-κB核转位;同时激活AMPK抑制LPS刺激后小鼠肺组织TNF-α和IL-6分泌、减弱肺湿干比值、肺髓过氧化物酶活性,从而改善LPS诱导的小鼠ALI。Mulchandani[13]等研究发现,在盲肠结扎穿孔诱导的脓毒症ALI模型,小鼠侧脑室注射AMPK激动剂AICAR减弱肺组织促炎因子TNF-α和IL-1β、角化细胞源性趋化因子、巨噬细胞炎症蛋白-2表达,减弱肺髓过氧化物酶活性,同时激活AMPK后肺组织形态学特征明显改善、凋亡细胞数量减少,脑部AMPK的激活减弱了脓毒症小鼠ALI。因此,AMPK 可能为ALI治疗提供新的靶点。
3. 结语
综上所述,AMPK在疾病炎症进程中发挥重要作用。激活AMPK可以改善神经退行性疾病、氧糖剥夺应激时神经细胞慢性炎症,减弱外周炎症、病原微生物等因素导致的血脑屏障完整性破坏,减少短暂性全脑缺血时的炎症反应,同时AMPK高表达在发育期大脑中发挥重要作用。AMPK激活还可以减少VSMCs迁移和炎症反应,降低单核细胞粘附性从而预防控制动脉粥样硬化,减少心血管疾病发生发展。此外,AMPK激活可以减少脓毒症等病因致ALI时一系列炎症反应和肺部损伤,从而改善预后。因此,AMPK 激活对机体病理炎症控制具有重要意义,AMPK介导的抗炎通路将有望为抗炎药物研发提供新方向。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
参考文献
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