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脂肪间充质干细胞治疗心肺复苏后大鼠缺血缺氧性脑病

来源:论文帮手 作者: 发布日期:2017-12-09 11:37:09

 

摘 要
近些年来,心肺复苏的成功率逐渐提高,但由于神经细胞对缺血缺氧敏感而且不能再生,大部分患者复苏后出现不可逆的神经损伤,导致失语、偏瘫、植物人等后遗症甚至导致死亡。尽管采取了亚低温治疗、药物治疗等综合措施治疗心搏骤停后的神经损伤,但是心搏骤停患者的出院生存率仍不高,在中国心搏骤停患者神经功能良好的出院率仅1%左右。如何减轻神经损伤、促进神经修复已成为现代医学的难题,在此我们尝试一种新措施治疗心搏骤停引起的神经损伤。
间充质干细胞具有高度自我更新能力,可以多次传代、大量扩增;同时还具有多向分化潜能,在一定的诱导条件下能分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞等。ADSCs是来源于脂肪组织的MSCs,其储备丰富,取材容易,其增殖分化能力高度稳定,不会随供者年龄产生变化。目前研究发现ADSCs在小动物脑梗塞模型中取得了良好效果,ADSCs移植能减少脑梗面积,减轻局灶性神经损伤,改善神经功能预后。而脑梗塞为局部性病灶,与心搏骤停引起的全脑范围的缺血性脑病,在病因、病理机制、临床表现上都有所不同,ADSCs对于心搏骤停引起的全脑范围的缺血缺氧性脑病的治疗效果及治疗机制需要进一步验证。
本实验研究异种移植ADSCs对心搏骤停后缺血缺氧性脑病的治疗效果,并探讨其作用机制,为临床治疗提供理论支持。主要内容包括:人ADSCs的培养,从细胞形态、细胞表型、多向分化能力等方面进行鉴定;采用窒息法建立大鼠心肺复苏模型并移植人ADSCs,观察ADSCs对心搏骤停后缺血缺氧性脑病的治疗效果,海马组织内BDNF、IL-6的表达情况。
第一部分  ADSCs培养及鉴定
研究目的 从人脂肪组织中分离、培养ADSCs,并从细胞形态、细胞表型、分化能力(成骨分化、成软骨分化、成脂肪分化)等方面进行鉴定,为下一步动物实验奠定基础。
材料和方法 从健康供者腹部抽取脂肪组织,消化、分离出血管基质部分,在37℃、5%CO2培养箱中使用DMEM/F12+10%胎牛血清培养基中贴壁培养,逐渐纯化为ADSCs,每3天换液1次,待细胞70%~90%融合时进行传代,培养过程中观察细胞形态。取第3代ADSCs采用流式细胞术检测细胞表面抗原CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR的表达情况。使用成骨分化试剂盒诱导成骨分化,第28天茜素红染色法、磷酸苯二钠基质(NBT/BCIP)染色法检测成骨分化情况;使用成软骨分化试剂盒诱导成软骨分化,第7天阿利辛蓝染色检测成软骨分化情况;使用成脂分化试剂盒诱导成脂分化,第21天油红O染色法检测成脂分化情况。
结果 原代培养24小时后,镜下可见短梭形、三角形等多种形态的贴壁细胞,随着时间增长,梭形细胞逐渐增多,呈长梭形外观,细胞成集落样生长,在6~8天后达到80%左右融合。传代后始终保持着稳定的增殖速度。ADSCs表面抗原CD73、CD90、CD105阳性表达率高,分别为99.99%、99.99%、96.88%,而CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR表达率低,分别为0.03%。成骨诱导后细胞生长旺盛,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,7天后可见结节样结构,28天后矿化结节形成明显,矿化结节被茜素红染色法染成红色结节,胞质因含有碱性磷酸被NBT/BCIP染色法染成深蓝色。成软骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐回缩变圆,7天后用阿利辛蓝染色检测软骨细胞基质中糖胺多糖合成情况,胞质被染成蓝色。成脂诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为圆形,胞浆内可见小脂滴,脂滴数量逐渐增加并相互融合,14天后油红O染色可见细胞内脂滴被染成红色。
结论 从人脂肪组织中分离并培养出稳定的ADSCs,从细胞形态、细胞表面抗原、多向分化能力3个方面对细胞进行鉴定,符合MSCs的鉴定标准。
第二部分  观察ADSCs移植对心肺复苏后缺血缺氧性脑病的治疗效果及保护机制研究
研究目的 观察异种ADSCs移植对大鼠心搏骤停后神经功能、神经元凋亡、血清S100B的影响,海马组织BDNF、IL-6的表达情况
材料和方法 54只大鼠随机分为3组(sham组、CA组、ADSCs组),每组18只。Sham组只进行外科操作,不进行心搏骤停及心肺复苏操作。CA组使用气管夹闭法诱导窒息性心搏骤停模型,心搏停止6分钟,复苏后1小时静脉注射1ml PBS。ADSCs组建立窒息性心搏骤停模型,心搏停止6分钟,复苏后1小时静脉注射人ADSCs 1ml(细胞计数5×106)。操作完成后24小时、72小时、168小时,每组随机选取6只大鼠进行检测。使用神经功能缺损评分评价神经功能,ELISA法检测血清S100B浓度,HE染色观察海马组织病理变化,TUNEL染色检测海马神经元凋亡率,werstern-blot检测海马BDNF、IL-6蛋白水平。
结果 
1.心搏骤停前采集到的大鼠体重、平均动脉压、心率,比较差异无统计学意义(P>0.05),心肺复苏期间窒息时间、按压时间及复苏后1小时MAP比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.神经功能缺损评分 在24小时、72小时、168小时,sham组大鼠评分高于ADSCs组和CA组,差异具有统计学意义(P<0.05),ADSCs组均高于CA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
3.病理变化Sham组大鼠结果正常。CA组大鼠海马区锥体细胞减少,锥体细胞稀疏,大量小胶质细胞增生。ADSCs组大鼠海马区少量细胞核皱缩改变,锥体细胞排列基本正常。
4.TUNEL染色 在3个时间点,sham组神经元凋亡率明显低于CA组和ADSCs组,差异具有统计学意义(P<0.05),而ADSCs组神经元凋亡率均低于CA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
5. 血清S100B浓度 在3个时间点,sham组血清S100B浓度均低于CA组和ADSCs组差异具有统计学意义(P<0.01),而ADSCs组S100B浓度低于CA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
6. 海马IL-6 在3个时间点,sham组IL-6表达水平低于CA组和ADSCs组,差异具有统计学意义(P<0.01)。在24小时、72小时,ADSCs组IL-6高于CA组,差异具有统计学意义(P<0.01)。复苏后168小时,ADSCs组和CA组IL-6比较差异无统计学意义(P>0.05)。
7.海马BDNF 在复苏后24小时,ADSCs组和CA组BDNF蛋白水平高于sham组(P<0.01),而ADSCs组BDNF蛋白高于CA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。在72小时,sham组和CA组BDNF蛋白比较无明显差异(P>0.05),而ADSCs组BDNF蛋白高于sham组和CA组(P<0.05)。在复苏后168小时,3组BDNF蛋白表达强度接近,差异无统计学意义(P>0.05)。
结论 心搏骤停能引起神经凋亡、神经功能障碍,ADSCs具有神经保护作用,能抑制神经细胞凋亡,改善神经功能预后。ADSCs可能是通过上调BDNF、IL-6表达发挥神经保护作用。
 
关键词:脂肪间充质干细胞、心搏骤停、缺血缺氧性脑病、神经保护作用、脑源性神经生长因子、白介素6
 
 
Abstract
In recent years, the rates of restoration of spontaneous circulation (ROSC) have gradual advanced, but neurons lack the capacity of regeneration, and are also sensitive to hypoxic/ischemic stress, most patients following ROSC have irreversible neurological injury, result in neurological sequelae such as aphasia, paralysis and vegetable state, or even death. Despite comprehensive measures such as mild hypothermia, medicine are adopted to reduce neurological injury, survival rates among patients with cardiac arrest (CA) are still low. In china, only about 1% patients survival to discharge from hospital with good neurological outcome. Reducing neuronal damage and promoting neurological recovery remain to be a critical problem in modern medicine. A new therapy for neurological injury following CA was attempted in the present research.
Mesenchymal stem cells (MSCs) have high self-renewal capacity and multilineage differentiation potential. In vitro, MSCs can be repeatedly passaged, expanded in large scale, and differentiate into adipocyte, osteoblasts, cartilage and neuron. Adipose derived stem cells (ADSCs) are MSCs derived from adipose tissue, with unique advantages such as abundant resource in adipose tissue, easiness to acquire by less invasion methods and stability capacity of proliferation and differentiation, which don’t decrease with aging. Current researches have demonstrated ADSCs had good neurological outcome in rats with the middle cerebral artery occlusion (MCAO). It is proved that ADSCs can reduce the size of cerebral infarction, alleviate focal neurological injury and promote the recovery of neurological function. Global brain ischemic injury following CA is different in pathogeny, pathology and clinical features, compared with MCAO, a focal cerebral ischemic model. Therapeutic mechanism and effect of ADSCs therapy in hypoxic ischemic encephalopathy following CA need further verification.
The purpose of this study is to evaluate the therapeutic effect and mechanisms of xenotransplantation human ADSCs in rat with hypoxic ischemic encephalopathy following CA, and provide theoretical basis for clinic. The main contents include culture and expansion of human ADSCs, identification from cell morphology, cell phenotype and multilineage differentiation ability, preparation of rats cardiac arrest model induced by asphyxia, therapeutic effect of human ADSCs in hypoxic ischemic encephalopathy following CA, the expression of brain derived neurotrophic factor (BDNF) and IL-6 in hippocampal tissue.
Part I Culture and identification of ADSCs
Objective To establish method for isolation, culture and proliferation of human ADSCs, identify properties of MSCs from cell morphology, cell phenotype and multilineage differentiation ability (osteogenic differentiation, chondrogenic differentiation, adipogenic differentiation), and establish basis for the next experiment.
Materials and Methods Adipose tissue was obtained from healthy volunteer by liposuction, and was minced, rinsed repeatedly with PBS solutions, digested with type I and II collagenase digestion under sterile conditions. Stromal vascular fraction (SVF) were cultured on culture media (DMEM/F12 with 10% fetal bovine serum) in an incubator with 37℃, 5%CO2, and purified to ADSCs. The culture media was changed every 3days. ADSCs were passaged when the cell fusion was over 80% of the flask. Cell morphology was observed during cell culture process. The cell phenotype (CD73, CD90, CD105, CD34, CD45, CD11b, CD19, HLA-DR) of ADSCs grown for 3 passages were detected using flow cytometry method. Osteogenic differentiation was induced by osteogenic differentiation kit, and detected through alizarin red staining and NBT-BCIP staining at 28days. Chondrogenic differentiation was induced by chondrogenic differentiation kit, and detected through alcian blue staining at 7days. Adipogenic differentiation was induced by adipogenic differentiation kit, and detected through Oil red O staining at 14days.
Result Primary cells adhered to the dish bottom after 24huors, which displayed fibroblast-like, spindle, or triangle shaped morphology. Cells began to proliferate and gradually grew to form small colonies. ADSCs were densely distributed, had uniform spindle morphology, and grew in a vortex-like manner. After 6~8days, cell fusion was over 80%. Proliferation capacity was stable in passage cells. The percentage of cell surface marker CD73 positive cells in ADSCs was 99.99%, respectively, of CD90 99.99%, respectively, and of CD105 96.88%, but CD34, CD45, CD11b, CD19, HLA-DR were found to be negative. After osteogenic differentiation, cells were vigorous growth, displayed short spindle or irregular shaped morphology, mineralization nodules were observed at 7days. At 28 days mineralization nodules were stained as red spots by alizarin red, which showed red bone-like tissue structures, and alkaline phosphatase (ALP) in osteoclasts cytoplasm as stained as blue precipitate by NBT-BCIP staining. After chondrogenic differentiation, the formation of round or oval nodules were observed under the microscope, cells were stained blue by alcian blue at 7days. After adipogenic differentiation, cells displayed round shaped morphology, lipid droplets were observed in kytoplasm, with positive oil red O staining at 14 days.
Conclusion ADSCs derived from human adipose tissue had stability proliferation capacity, showed positive expression of CD73, CD90, CD105, and negative expression of CD34, CD45, CD11b, CD19 and HLA-DR. ADSCs can differentiate into osteoblasts, chondrocytes and adipose cells.
Part Ⅱ Therapeutic effect and protection mechanism of human ADSCs in hypoxic ischemic encephalopathy following CA
Objective To observe changes about neurological function, neurons apoptosis, serum S100B after transplantation of human ADSCs in rat with hypoxic ischemic encephalopathy following CA, and investigate the expression of BDNF and IL-6 in hippocampal tissue.
Materials and Methods 54 rats were randomly divided into 3 groups: sham group, Cardiac arrest group, and ADSCs group. Rats in sham group only went through surgical procedures, without CA and CPR. Rats in CA group went through CA and CPR and received 1mL PBS buffer by intravenous injection at one hour after restoration of spontaneous circulation (ROSC), while rats in ADSCs group went through CA and CPR and received 1mL ADSCs (5×106 cells) by intravenous injection. At 24, 72, and 168 hours after operation, 6 rats in each group were randomly selected and euthanized. Hypoxic brain damage was evaluated using Neurological Deficit Scale Score (NDS), serum s100-β was detected by ELISA, and apoptosis rates of hippocampal neural were detected by TUNEL staining, protein levels of BDNF and IL-6 in the hippocampus were detected by western blot.
Result 1.Weight, mean arterial pressure and heart rate of rats before CA were collected, there were no significant difference among 3 groups (P>0.05). Duration of asphyxia, duration of CPR and MAP 1hour after ROSC showed no significant difference among 3 groups (P>0.05).
2.NDS score of sham group was significantly higher than ADSCs group and CA group at 24 hours, 72hours,168 hours after ROSC (P<0.05), and NDS score of ADSCs group was increased compared with CA group at each time point (P<0.05).
3. Hippocampal tissue in sham group was determined to be morphologically normal. In CA group, necrosis of pyramidal cells and proliferation of glial cells were observed in hippocampal CA1 region. ADSCs group also showed necrosis of pyramidal cells, however numbers of necrotic cells were significantly lower in ADSCs group, as compared with CA group.
4. At each time point, rats in CA group and ADSCs group showed a large number of TUNEL positive cells after ROSC, which were significantly higher than sham group (P<0.05), and ratio of hippocampal neuronal apoptosis was significantly decreased in ADSCs group, as compared with CA group (P<0.05).
5. At each time point, S100B levels in CA group and ADSCs group were significantly higher than in sham group (P<0.01), while levels of S100B were significantly decreased in ADSCs group compared with CA group ( P<0.05).
6. Compared with IL-6 in sham group, IL-6 levels of hippocampus in CA group and ADSCs group were increased at each time point (P<0.01). At 24 hours and 72hours after CPR, IL-6 level in ADSCs group was significantly higher than in CA group (P<0.01), while at 168 hours after CPR, IL-6 level showed no significant difference between CA group and ADSCs group(P>0.05).
7. At 24 hours after ROSC, BDNF protein levels in CA group and ADSCs group were significantly higher than in sham group(P<0.01), while BDNF protein level were significantly increased in ADSCs group compared with CA group(P<0.05). At 72 hours after ROSC, BDNF protein levels showed no significant difference between sham group and CA group (P>0.05), but BDNF protein levels group were significantly increased in ADSCs compared with CA group (P<0.05). At 172 hours after ROSC, BDNF protein levels showed no significant difference among 3 groups (P>0.05).
Conclusion CA cause severe neurological dysfunction and neuronal apoptosis, ADSCs transplantation can reduce neurological injury and improve the prognosis of neurological function. The neuroprotective effect is related with up-regulated expression of BDNF and IL-6. 
 
KEY WORDS adipose derived stem cells, cardiac arrest, hypoxic ischemic encephalopathy, neuroprotective effect, brain derived neurotrophic factor, IL-6
 
英文缩略词
缩写 英文全称 中文全称
CA Cardiac arrest 心搏骤停
CPR Cardiopulmonary Resuscitation 心肺复苏
ROSC Restoration of spontaneous circulation 自主循环恢复
ADSCs Adipose derived stem cells 脂肪间充质干细胞
BMSCs Bone marrow mesenchymal stem cells 骨髓间充质干细胞
MSCs Mesenchymal stem cells 间充质干细胞
CPC cerebral performance category score 大脑功能分级
MCAO Middle cerebral artery occlusion 大脑中动脉梗塞
BDNF Brain derived neurotrophic factor 脑源性神经生长因子
IL-6 Interleukin-6 白介素-6
MAP Mean arterial pressure 平均动脉压
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附测定
SVF Stromal vascular fraction 血管基质部分
PBS Phosphate buffer saline 磷酸缓冲盐溶液
SDS-PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳
NSE Neuron-specific enolase 神经元特异性烯醇化酶
TrkB Tropomyosin-related kinase receptor type B 原肌球蛋白相关激酶B
NO Nitric oxide 一氧化氮
Bcl-2 B-cell lymphoma 2 B淋巴细胞瘤-2
Mcl-1 Myeloid cell leukemia-1 髓细胞白血病-1
Mn-SOD Manganese superoxide dismutase 锰超氧化物歧化酶
TNF-α Tumor necrosis factor-α 肿瘤坏死因子-α
IL-1β Interleukin-1β 白介素-1β
第一部分 ADSCs培养及鉴定
一、前言
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类中胚层来源的具有多向分化潜能的非造血干细胞。在一定的诱导条件下,它能分化为中胚层细胞,如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、腱细胞、成纤维细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞等,还能跨胚层分化为外胚层细胞(神经细胞)及内胚层细胞(肝细胞)[1]。MSCs来源广泛,目前已在骨髓、脂肪、牙髓、脐带、胎盘等组织中成功分离出MSCs。自从Friedenstein等人[2]首次从骨髓中分离出了MSCs以来,BMSCs已成为研究最多的的间充质干细胞之一。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有稳定的增殖、分化能力,但是也存在一些不足:取材过程痛苦,获取率低,其细胞数及分化能力随供者年龄增长呈下降趋势[3, 4]。脂肪间充质干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)除了具有和BMSCs相似的增殖、分化能力,还具有一些独特的优点:脂肪储备丰富,取材痛苦小;ADSCs提取率高、易于培养;其分化能力稳定,不会随供者年龄增长出现下降趋势[4, 5];不牵涉伦理学。基于以上特点,ADSCs很有可能取代BMSCs成为再生医学新的细胞来源。
但是ADSCs提取分离及培养过程中易混入其它细胞或微生物导致污染,因此需要在使用前对ADSCs进行鉴定,判断培养细胞是否符合MSCs的定义。本实验采用抽脂术从成人腹部抽取脂肪并分离培养ADSCs,检测其表面抗原表达情况,诱导成骨成软骨成脂分化了解其分化能力,为下一步动物实验奠定基础。
二、材料与方法
(一)实验材料、试剂及仪器
1、实验材料
脂肪组织 采用吸脂术从健康志愿者腹部吸取100ml脂肪组织,供者对实验内容知情,并签署知情同意书。
2、实验试剂
DMEM/F12培养基   Gibco公司 美国
10%胎牛血清   Gibco公司 美国
胰蛋白酶   Gibco公司 美国
PBS   武汉博士德生物公司 中国
EDTA   Sigma公司 美国
I型胶原酶   Gibco公司 美国
FITC标记鼠抗人CD90单克隆抗体         BD Biolegend公司 美国
FITC标记鼠抗人CD105单克隆抗体   BD Biolegend公司 美国
FITC标记鼠抗人CD73单克隆抗体   BD Biolegend公司 美国
FITC标记鼠抗人CD34单克隆抗体   BD Biolegend公司 美国
FITC标记鼠抗人CD45单克隆抗体   BD Biolegend公司 美国
FITC标记鼠抗人CD11b单克隆抗体     BD Biolegend公司 美国
FITC标记鼠抗人CD19单克隆抗体   BD Biolegend公司 美国
FITC标记鼠抗人HLA-DR单克隆抗体   BD Biolegend公司 美国
成脂肪分化试剂盒 Thermo公司 美国
成软骨分化试剂盒 Thermo公司 美国
成骨分化试剂盒 Thermo公司 美国
茜素红 威佳公司 中国
油红O Sigma公司 美国
阿利辛蓝 Sigma公司 美国
磷酸苯二钠基质(NBT-BCIP) 碧云天生物科技公司 中国
3、实验仪器
流式细胞仪 Canto Ⅱ,Becton Dikinson公司 美国
超净工作台 苏州净化仪器厂 中国
二氧化碳培养箱 HERAcell 240i,Thermo公司 美国
数显电热恒温水浴箱 金坛瑞化仪器有限公司 中国
倒置相差显微镜 CKX31,OLYMPUS公司 日本
冷冻离心机 neofuge 15R,力新仪器有限公司 中国
培养板 BD公司 美国
25cm2培养瓶 BD公司 美国
(二)实验方法
1、ADSCs培养、传代
将脂肪组织放入准备好的无菌PBS溶液,反复冲洗,剔除小血管。使用眼科剪将脂肪组织剪碎,加入等体积的0.1% I型胶原酶,在37℃气浴摇床内震荡消化40分钟。消化完成后,加入等体积培养基(DMEM/F12+10%胎牛血清)终止消化,然后在1000转/分下离心10分钟,弃上清,收集细胞,加入培养基重悬细胞,以1×105/cm2密度接种于培养瓶中,放入37℃、5%CO2培养箱中培养。24小时后半量换液,洗掉未粘附细胞。以后每3天换液1次,当细胞70%~90%融合时,吸去培养基,PBS漂洗3次,吸出漂洗液。加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化液1ml,显微镜观察可见细胞间隙增大,细胞变圆,少量细胞漂起时,加入1ml PBS中止消化,用移液枪轻柔吹打,使残留贴壁细胞脱落。将细胞悬液移入离心管内,离心后弃去上清液。加入培养基(DMEM/F12+10%胎牛血清)重悬细胞,以1:2比例传代培养。倒置显微镜观察生长情况,细胞接近80%融合时重复上述操作。
2、ADSCs表面抗原检测
用流式细胞术检测第3代ADSCs表面特异性抗原。用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化细胞后,1000转/分速度下离心5分钟,PBS洗涤并重悬细胞,细胞密度调整为1×106/ml。吸取细胞悬液100μl,分别加入FITC标记的小鼠抗人单克隆抗体CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR,在4℃下避光孵育30分钟。PBS洗去未标记的抗体,离心去上清后加300μlPBS,用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达情况。
3、ADSCs成骨成脂分化
(1)成骨诱导
取第5代ADSCs以5×103/cm2的密度接种于六孔板中,待细胞融合接近80%时,加入成骨诱导培养基,每3天更换1次培养基,诱导28天。
茜素红染色法观察钙化结节。成骨诱导后PBS漂洗3次,用4%多聚甲醛溶液固定细胞20分钟,清洗后每孔加入茜素红染色液,室温下染色20分钟,蒸馏水冲洗,相差显微镜下观察钙化结节形成情况。
磷酸苯二钠基质(NBT-BCIP)染色法观察碱性磷酸酶表达情况。成骨诱导后PBS漂洗3次,用4%多聚甲醛溶液固定细胞20分钟,清洗后使用NBT-BCIP试剂盒室温下避光染色1小时分钟,蒸馏水冲洗,显微镜下观察碱性磷酸酶染色情况。
(2)成软骨诱导
将ADSCs以5×103/cm2的密度接种于六孔板中,加入软骨诱导培养基,培养7天,每3天换液1次。PBS漂洗细胞3次,用4%多聚甲醛溶液固定细胞20分钟,清洗后用阿利辛蓝染液染色30分钟,自来水冲洗2分钟,加蒸馏水终止染色。显微镜下观察染色情况。
(3)成脂肪诱导
将ADSCs以5×103/cm2的密度接种于六孔板中,加入脂肪诱导培养基,培养21天,PBS漂洗3次,用4%多聚甲醛溶液固定细胞1小时,清洗后每孔加入油红O染色液1ml,室温下染色30分钟,蒸馏水洗清洗,相差显微镜下观察脂质沉积情况。
三、结果
(一)ADSCs形态学观察
ADSCs原代培养24小时后,镜下可见短梭形、三角形、多角形等多种形态的贴壁细胞,散在少量圆形细胞,随着时间增长,细胞形态均一呈长梭形外观,旋涡状分布(见图1),在6~8天后达到80%左右融合。传代后细胞始终保持着稳定的增殖速度。
(二)、ADSCs表面抗原表达情况
流式细胞术检测结果:ADSCs表面抗原CD73、CD90、CD105阳性表达率高,分别为99.99%、99.99%、96.88%,而CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR表达率低,分别为0.03%(图2)。
(三)、ADSCs成骨成软骨成脂分化情况
在分化诱导前,ADSCs贴壁生长,呈扁平形或长梭形的成纤维样细胞,加入相应的诱导培养基,能分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞(图3)。
成骨诱导后细胞生长旺盛,诱导培养约3天后,细胞形态由长梭形逐渐变为不规则形态,7天后可见结节样结构,28天后矿化结节形成明显,经茜素红染色可见已形成的矿化结节被染成红色结节。NBT/BCIP染色检测碱性磷酸酶活性,胞内含有碱性磷酸酶被染成深蓝色。
成脂诱导约3天后,细胞形态由长梭形逐渐变为圆形,胞浆内可见小脂滴,脂滴数量逐渐增加,并有相互融合趋势,14天后经油红O染色可见细胞内脂滴被染成红色。
成软骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐回缩变圆,胞质减少,7天后用阿利辛蓝染色检测软骨细胞基质中糖胺多糖合成情况,可见细胞被染成蓝色。
 
图1 ADSCs形态(40×)细胞呈长梭形,旋涡状分布
图2 流式术检测ADSCs表面抗原 
 
四、讨论
相比其它来源的MSCs,ADSCs的优势之一就是贮备丰富。目前肥胖人群逐渐增多,有大量的脂肪资源贮备。获取脂肪的方法大部分为吸脂术,操作相对简单,痛苦小,给供者带来的负面影响也较小。根据文献报道,1g脂肪组织中可获得0.5×106~2×106血管基质部分(stromal vascular fraction,SVF),SVF培养后可获得0.5×104~2×105ADSCs[6]。目前从脂肪组织中获取ADSCs的基本方法是酶消化法,将脂肪组织剪碎后使用胶原酶消化30~60分钟,离心后可得到SVF。SVF是混合细胞,包含了ADSCs、脂肪前体细胞、脂肪细胞、血细胞等多种细胞[7],SVF经过间充质干细胞培养基培养,ADSCs大量增殖并具有贴壁特性,数次传代后逐渐纯化并分离出来。研究证明,ADSCs的增殖及分化能力非常稳定,几乎不会随着供者年龄增长出现变化[4, 5]。ADSCs已成为全球生命科学研究领域的一大热点和前沿,每年都有大量相关的文献报道。
然而脂肪组织来源、脂肪种类以及分离、纯化、培养方法不完全一致,培养出的ADSCs细胞表型及分化能力存在一定差异,给研究工作带来一定的困扰。2006年国际细胞治疗协会提出了MSCs最基本定义[8],对临床前研究及临床应用提供了指导。2013年国际脂肪干细胞治疗与科学联合会发布了指南,提供了ADSCs的标准及与易混淆细胞的鉴别[9]。尽管有多篇指南指导研究工作,ADSCs研究中仍然存在不恰当使用的情况,尤其是SVF和ADSCs之间的误用。有文献调查了指南发布后的ADSCs的使用情况,其中约8.51%的ADSCs研究宣称使用ADSCs,而实际上误用了其它不能扩增的细胞,另外有大量关于ADSCs的研究误用了SVF[10]。结合多篇相关文献指南,ADSCs可以从细胞生长形态(长梭形、贴壁生长)、表面抗原表达情况(表达CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR)、及多向分化能力(能分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞)三个方面进行鉴定。
本研究使用的分离及培养方法能稳定获得人来源的ADSCs,所培养的ADSCs具有贴壁生长的特点,形态均一呈长梭形,且传代稳定,至第10代时仍具有稳定的增殖及传代能力。采用流式细胞术检测ADSCs表面细胞分化抗原表达情况,与各项指南中的标准一致,表达间质细胞相关抗原(CD73、CD90、CD105),不表达造血干细胞相关抗原(CD34、CD45、CD11b)及组织相容性Ⅱ类抗原(HLA-DR)。随后ADSCs在特定的培养基中,进行成骨成软骨成脂诱导,并使用特异的染色方法,证明了其分化情况。茜素红染色法证明已形成矿化结节,NBT/BCIP证明有胞浆中含有大量碱性磷酸酶,矿化结节及碱性磷酸酶都是成骨细胞分化成熟的标志物。阿利辛蓝染色证明糖胺多糖沉积,而蛋白聚糖是鉴定软骨细胞的主要指标。油红O染色可见细胞内脂滴被染成红色,可证明脂肪细胞形成。
综上所述,脂肪组织储备丰富,易于获取,是理想的多能干细胞来源,ADSCs培养简单,增殖、分化能力稳定,在疾病的研究和应用中有广阔前景。但在研究中,需按照指南标准进行鉴定,确定细胞为高质量的ADSCs。
五、结论
本实验从人脂肪组织中分离并培养出稳定的ADSCs,从细胞形态、细胞表面抗原、多向分化能力3个方面对细胞进行鉴定,符合MSCs鉴定标准,为下一步实验打下基础。
 
第二部分 观察ADSCs移植对心肺复苏后缺血缺氧性脑病的治疗效果及保护机制研究
一、前言
近年来,随着经济的快速发展和生活环境的改变,中国心搏骤停的发生率逐年上升,已经成为青壮年人群的主要死亡原因,预计中国每年超过54.4万人因突发心搏骤停导致死亡[11]。尽管近些年来随着心肺复苏技术的推广和医疗技术的进步,在心搏骤停的治疗上取得了一些进步,但病人的出院率仍不高,在中国,院外心搏骤停患者神经功能良好的出院生存率仅有1%左右[12, 13],主要原因是缺血后不可逆的神经损伤导致偏瘫、植物人状态等神经系统后遗症甚至导致死亡。研究显示,在复苏成功的患者中约28~34%遗留明显的神经功能障碍(大脑功能分级(cerebral performance category score,CPC)>1),约10%患者遗留严重神经功能障碍(CPC>2)[13],其中高龄、女性、非白种人、疾病负担、周末发病与神经功能障碍密切相关[15]。目前心搏骤停后的缺血缺氧性脑病仍缺乏有效的治疗措施,是急诊医学的研究的重点。
心搏骤停相关脑损伤经历全脑缺血再灌注的过程。当出现心搏骤停时,有效的血流灌注几乎为零,大脑处于无灌注状态,在此阶段,ATP在数分钟内耗尽,神经细胞膜上ATP依赖性钠钾泵出现功能障碍,导致血脑屏障破坏、细胞内钙超载、细胞内酸中毒及神经性水肿[16];同时还牵涉到谷氨酸盐介导的兴奋毒性、血管内皮损伤、活化的中性粒细胞释放炎性介质、活化的血小板释放血管活性物质等。当开始心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation,CPR)时,有效CPR提供的心输出量仅相当于正常时25%~40%,而大脑接受约其中30%血流量[17],处于低灌注状态。在此阶段,活化的中性粒细胞、血小板在毛细血管内积聚,血液凝固系统激活形成微血栓,同时内源性α肾上腺受体激动剂或肾上腺素进一步减少毛细血管血流,导致无复流现象。复苏成功后自主循环恢复,再灌注产生大量钙离子内流,并生成大量氧自由基。此时脑血流自动调节机制尚未恢复,导致脑灌注在不同部位存在差异,部分区域仍经历持续性低灌注,而其它区域处于相对高灌注水平。低灌注导致缺血性神经坏死,高灌注导致水肿和继发性神经损伤[16, 18]。在复苏后数小时内,血液中多种促炎介质急剧升高并达到峰值,出现全身炎症反应综合症[19]。促炎因子在脑损伤部位积聚,并招募炎症细胞聚集到损伤部位,加重缺血性损伤或者引起继发性神经毒性。上述多种机制相互影响,级联放大,直至出现神经元坏死或凋亡。对缺血敏感的海马、皮质等部位神经元最早凋亡、坏死。当出现神经元大量缺失时,出现不可逆的神经功能障碍。
目前,仅有亚低温被指南推荐用于脑复苏的治疗,但是亚低温的标准仍未统一,低温治疗开始时间、持续时间及温度范围都存在争议,且亚低温难以逆转已形成的脑损伤。目前已有关于ADSCs治疗缺血缺氧性脑病的相关研究,ADSCs移植治疗于大鼠中动脉梗塞 (middle cerebral artery occlusion,MCAO) 模型,可以减少脑梗面积,促进神经功能恢复[19, 20]。目前ADSCs移植治疗大鼠MCAO模型的研究较多,而ADSCs治疗心肺复苏后全脑范围缺血缺氧的文献较少。MCAO模型为局部性病灶,与心搏骤停引起的全脑范围的缺血性脑病,在病因、病理机制、临床表现上都不相同。小动物心搏骤停模型可由窒息法或致颤法诱导,其中窒息法模仿呼吸道梗阻引起的心搏骤停,致颤法模仿恶性心律失常引起的心搏骤停,有研究发现,两种方法复苏成功率相仿,但窒息法引起的缺血性脑损伤程度更加严重[22, 23]。因此,本研究部分选取窒息法诱导心搏骤停后的全脑缺血缺氧模型为研究对象,探讨ADSCs对复苏后全脑缺血缺氧损伤的治疗作用及相关作用机制。主要研究内容:○1采用窒息法建立大鼠心肺复苏模型;○2静脉注射人ADSCs,使用神经功能缺损评分评价神经功能改善情况,海马神经元凋亡、血清S100B评估神经损伤情况,海马组织中白介素-6(interleukin-6,IL-6)、脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)表达情况。
二、材料与方法
(一)实验动物、试剂及仪器
1、实验动物
健康雄性SD大鼠,体重350~450g(约10周龄),由 动物实验中心提供。
2、主要试剂
戊巴比妥钠 Merck公司 德国
4%多聚甲醛 AMRESCO公司 美国
戊二醛 AMRESCO公司 美国
肝素钠注射液 上海第一生化药业有限公司 中国
大鼠S100B酶联免疫吸附测定试剂盒 上海圆创生物科技有限公司 中国
Actin小鼠单克隆抗体 ABCAM公司 英国
IL-6兔抗鼠多克隆抗体 ABCAM公司 英国
BDNF小鼠抗大鼠单克隆抗体 ABCAM公司 英国
HRP标记羊抗兔IgG Jackson公司 美国
HRP标记兔抗鼠 IgG Jackson公司 美国
TUNEL试剂盒 Roche公司 德国
BCA试剂盒 北京博奥森生物技术有限公司 中国
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X) 上海碧云天生物技术有限公司 中国
ECL试剂盒 Thermo公司 美国
蛋白上样缓冲液5× 上海碧云天生物技术有限公司 中国
SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司 中国
RIPA裂解液 上海碧云天生物技术有限公司 中国
3、实验仪器
小动物呼吸机 ALC-V8S,上海奥尔科特生物科技有限公司 中国
生物信号分析系统 MPA,上海奥尔科特生物科技有限公司 中国
气管导管 上海奥尔科特生物科技有限公司 中国
传感器 上海奥尔科特生物科技有限公司 中国
动物体温计 TD550,深圳市大雄测控科技有限公司 中国
电子天平 PL-203,梅特勒-托利多仪器有限公司 中国
小动物电子秤 SF400A,深圳市深洋电子衡器有限公司 中国
冷冻离心机 neofuge 15R,力新仪器有限公司 中国
台式离心机 TGL-16c,上海安亭科学仪器厂 中国
电泳仪 DYY-6C,北京六一仪器厂 中国
封口机 PF-S-200,温州市江南机械厂 中国
暗匣 AX-Ⅱ,广东粤华医疗器械厂有限公司 中国
4、手术相关用品
大鼠固定器、眼科镊、眼科剪、蚊氏钳、血管钳、有齿镊、无齿镊、组织剪、线剪、血管夹、玻璃分针、PE-50聚乙烯导管、医用纱布、棉球、棉签、3M医用胶带、3号、5号医用缝合线、1ml、2ml、5ml、20ml无菌注射器、无菌手套。
(二)实验方法
1、窒息法心搏骤停/心肺复苏模型制备
操作前12小时大鼠禁食,可自由饮水。称重后,腹腔注射预先配好的3%戊巴比妥溶液(45mg/kg),如有必要以10 mg/(kg•h)速度补充麻醉。麻醉后大鼠仰卧位固定于手术台上,用小动物剃毛器剔除颈部、前胸及右侧腹股沟区毛发。消毒颈部皮肤,于颈部胸骨上窝往上1cm处沿颈前正中线做长约1cm的纵向切口,钝性分离皮下组织、肌肉,暴露气管。用14G带芯导管作为气管导管经口插入,确认导管在气管内,然后拔出管芯,固定气管导管。消毒右侧腹股沟皮肤,在腹股沟正中行长约1.5cm纵行切口,钝性分离皮下组织、肌肉,暴露股动脉及股静脉。游离右股静脉,结扎远心端,用眼科剪在结扎处上方将股静脉剪一小口,用PE-50聚乙烯导管插入,到达下腔静脉,用5号线打结固定导管,导管充满5U/ml肝素生理盐水预防凝血,用于给药。游离右股动脉,于股动脉近端用血管夹阻断血流,远心端结扎,结扎处上方用眼科剪将股动脉剪一小口,用PE-50聚乙烯导管插入后放开血管夹,继续缓慢送入导管到达胸主动脉,导管内充满肝素生理盐水,用5号线打结固定导管,连接传感器实时记录动脉压。探针刺入大鼠四肢皮下组织,实时监测Ⅱ导联心电图。肛门插入内置式温度探头记录直肠温度。在操作过程中,控制动物的肛温在36℃~37℃。外科操作完成后稳定30分钟,记录基础血压、心率、体温等参数,准备开始心搏骤停。夹闭气管导管进行窒息,监测动物收缩压,待动脉收缩压降至25mmHg即判定为心脏停搏。心搏停止6分钟后即开始频率为160次/min的人工胸外按压(用设定频率为160次/min节拍器引导按压频率,按压位置为大鼠剑突上一横指处,按压深度为胸廓前后径的1/3)和80次/min的同步机械通气(潮气量为0.65ml/100g,频率为80次/分,吸入氧浓度为0.21)。按压2min后如未恢复自主循环给予20ug/kg肾上腺素静推。按压期间观察心电图表现,如动物在按压过程中出现室颤,则给予2 J的能量除颤,除颤后继续按压。判定自主循环恢复的指标:恢复室上性心律,平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)≥60 mmHg并且维持10 min以上。大鼠经上述过程抢救10min自主循环未能恢复者判定复苏失败,放弃抢救。自主循环恢复的大鼠继续机械通气、监测血流动力学相关指标2小时,实验结束后拔除所有导管,消毒缝合切口,单独入笼,皮下注射5%糖盐水5ml,自由饮水活动。
2、分组
54只大鼠编号后按随机数字表法分为3组:sham组,CA组和ADSCs组;每组18只大鼠。Sham组大鼠只进行外科操作,不进行心搏骤停及心肺复苏操作。CA组和ADSCs大鼠进行心搏骤停及心肺复苏,如大鼠复苏失败,则由备用老鼠补充行心肺复苏模型制备。每组大鼠分别在操作完成后24小时、72小时、168小时随机选取6只大鼠,进行相关检测。
3、ADSCs移植
在自主循环恢复后1小时,CA组大鼠通过股静脉缓慢静脉注射1ml PBS缓冲液,ADSCs组大鼠静脉注射1ml ADSCs悬液(细胞计数5×106)。
4、指标检测
每组大鼠分别在操作完成后24小时、72小时、168小时随机选取6只大鼠,取血及海马组织进行下列检测。
(1)神经功能评价
神经功能评价使用神经功能缺损评分量表[24](表1)作为标准。评分内容由多种神经功能实验组成,包括总体状态、脑干功能、运动功能、感觉功能、平衡能力、简单反射功能、癫痫发作情况,评分范围0~80分,0分代表脑死亡,80分代表神经功能正常,评分越高代表神经功能越好。评分由不知道分组情况的实验人员实施。
 
表1 神经功能缺损评分
A总体状态     总分19分
意识状态 正常      10分 木僵      5分 昏迷      0分
觉醒状态 自发睁眼  3分 疼痛睁眼  1分 不睁眼    0分
呼吸状态 正常      6分 异常      0分 无        0分
B脑干功能     总分21分
嗅觉 有        3分 无        0分
视觉 有        3分 无        0分
瞳孔反射 有        3分 无        0分
角膜反射 有        3分 无        0分
惊跳反射 有        3分 无        0分
胡须刺激 有        3分 无        0分
吞咽功能 有        3分 无        0分
C运动功能     总分6分
左侧肌力 正常      3分 僵直或弱    1分 无运动或瘫痪 0分
右侧肌力 正常      3分 僵直或弱    1分 无运动或瘫痪 0分
D感觉功能     总分6分
左侧疼痛刺激 快速回缩  3分 回缩慢/反应异常 1分 不回缩     0分
右侧疼痛刺激 快速回缩  3分 回缩慢/反应异常 1分 不回缩     0分
E运动行为     总分6分
步态协调 正常      3分 异常      1分 缺失       0分
平衡木试验 正常      3分 异常      1分 缺失       0分
F行为         总分12分
翻正反射 正常      3分 异常      1分 缺失       0分
负向趋地性 正常      3分 异常      1分 缺失       0分
视觉定位 正常      3分 异常      1分 缺失       0分
胡同转身试验 正常      3分 异常      1分 缺失       0分
G癫痫         总分10分
癫痫发作 无        10分 局部发作  5分 全面发作   0分
(2)ELISA法检测血清s100B
评分后,大鼠腹腔注射3%戊巴比妥溶液(45mg/kg),麻醉后用上文所描述方法在左侧股静脉置管,抽血1ml。血样注入离心管,静置10分钟,1500转/分速度下离心15分钟,用微量移液器将上层清亮血清移入冻存管,放进-80℃冰箱存。待标本收集完毕,使用双抗体酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清S100B浓度。
取出试剂盒,在室温下复温。建立标准曲线,标准孔8孔,每孔100μl,标准品浓度呈2倍递减,分别为800pg/ml、400pg/ml、200pg/ml、100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml,第8孔为空白对照。每个待测孔中加血清100μl,反应板充分混匀后置于室温下静置2小时。用洗涤液将反应板充分洗涤6次,滤纸上印干。每孔加入第一工作液100μl,充分混匀后静置60分钟,再次洗板,每孔加入酶标抗体工作液100μl,反应板充分混匀后静置60分钟。洗板,每孔加入底物工作液,置于暗处反应15分钟,每孔加入50μl终止液混匀,30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光度(OD值)。以标准品OD值在半对数纸上进行作图,画出标准曲线。根据血清OD值在该曲线图上查出相应大鼠血清S100B浓度。
(3)制作石蜡切片及HE染色
取血后,静脉注射3%戊巴比妥溶液2ml使大鼠过量麻醉死亡。快速断头取脑,在冰盘上分离海马组织,修整组织后将左侧海马放入4%多聚甲醛溶液固定。右侧海马放入冻存管,在液氮罐中冻存。
组织固定48小时后,分别脱水、透明、浸蜡、包埋:在50%、70%、80%、90%、95%、100%梯度酒精中分别脱水1~2小时,2次二甲苯每次30分钟至组织透明。浸蜡2次,每次1小时,包埋机包埋蜡块。在海马齿状回平面作石蜡切片,厚5 μm。60℃恒温箱中烘烤60分钟。
染色前,切片用二甲苯脱去石蜡,再经由高到低浓度梯度酒精浸泡后蒸馏水洗。苏木精染色液染色5分钟,0.5%盐酸酒精分化30秒,蒸馏水洗5分钟,氨水返蓝1分钟,蒸馏水短洗,伊红染液浸染2分钟。依次经历70%、85%、95%、100%梯度酒精短暂脱水,二甲苯透明2次各5分钟,加适量中性树胶凝固,封片。显微镜下观察海马CA1区并拍片。
(4)TUNEL染色检测海马神经凋亡
将上述石蜡切片至于染色缸中,二甲苯脱蜡浸洗2次共5分钟,100%、95%、90%、80%、70%梯度酒精各浸洗3min;3%过氧化氢甲醇中浸洗10-15min,用蛋白酶K室温孵育15~30分钟。PBS洗2次各约5min,滴加50μl的TUNEL反应混合液(试剂1中取5μl+试剂2中45μl标记液中),在湿盒中37℃孵育60分钟。擦干多余水分,加入50μl转化剂-POD,湿盒中37℃孵育20分钟。加入50μlDAB底物溶液,室温孵育10分钟,PBS冲洗5次。中性树胶封片,显微镜观察并拍片分析结果。
(5)蛋白印迹法检测海马组织中IL-6、BDNF蛋白表达
提取蛋白:出液氮罐保存的海马组织,玻璃匀浆器研磨后加入EP管,各加细胞裂解液300μl置于冰上裂解1小时,15000转/分低温离心15分钟,吸取上清,加入样品缓冲液,置于沸水浴槽中加热2分钟使蛋白变性。
BCA法总蛋白定量:BCA试剂A和BCA试剂B按照50:1的比例配制BCA工作液,充分混匀。取10μl标准品用PBS稀释至100μl,分别取0、1、2、4、8、12、16、20μl加入标准孔,加PBS补足至20μl。取适量上清至样品板,加入PBS补足20μl,加入200μl BCA工作液,37℃静置30分钟。酶标仪测A562,根据标准曲线计算蛋白浓度。
上样:吸取40μg总蛋白,按体积比4:1的比例加入聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液5X,100℃水浴变性5分钟后上样。电泳:配制10% SDS-PAGE分离胶,4%浓缩胶,用微量移液器将蛋白按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。电泳初始电压70V(30分钟),当溴酚蓝前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V,继续电泳直至溴酚蓝泳出约分离胶的下缘(约60分钟)。转膜:取出凝胶浸泡于转移缓冲液中,硝酸纤维素膜浸泡于转移缓冲液中待用,按顺序在转移盒内放置海绵、滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸、海绵,保证每层之间没有气泡。将转移盒放入转移槽,膜在正极、胶在负极,90V电压转移2小时。封闭:硝酸纤维素膜(NC膜)浸于5%脱脂奶粉,封闭2小时。洗膜及杂交:TBS-T洗膜3次,各10分钟;一抗(BDNF小鼠抗大鼠/IL-6兔抗鼠)1:1000稀释,内参Actin1:10000稀释,加入杂交袋中,4℃孵育过夜;T-TBS洗膜3次各10分钟,二抗辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔/兔抗鼠IgG抗体1:3000稀释,加入杂交袋中。孵育60分钟;T-TBS洗膜3次10分钟。化学发光:将ECLA和ECLB两种试剂等体积混合,将NC膜的蛋白面朝上与此混合液充分接触1-2min,放入暗匣中曝光。最后用显影、定影试剂进行显影和定影。将胶片进行扫描存档,PhotoShop整理去色,alpha EaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。
4、统计学方法
计量资料以均数±标准差(±s)表示,使用SPSS21.0统计软件进行处理。同一时间点组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。计数资料(n≥40且T≥5)比较采用Pearson卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。
 
三、实验结果
(一)大鼠一般情况
心搏骤停前采集到的大鼠体重、MAP、心率(表2)进行对比,差异无统计学意义(P>0.05);CA组、ADSCs组各个时间点心肺复苏期间窒息时间(从夹闭导管到CA)、按压时间(心肺复苏到恢复自主循环)、复苏后1小时MAP比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
心肺复苏模型共使用51只大鼠(15只复苏失败),窒息开始后,大鼠剧烈挣扎,血压、心率缓慢下降,约2分钟左右出现平台期,血压波动在100-130/60-70mmHg,心率波动在130-170次/分,平台期持续约2分钟后血压、心率快速下降。当判定心搏骤停时,9只大鼠表现为室颤,42只大鼠表现为无脉性电活动。CA组大鼠死亡8只,成功18只,死亡率30.77%,ADSCs组大鼠死亡7只,成功18只,死亡率28.00%(复苏失败的大鼠从备用组补充);两组间死亡率对比,差异无统计学意义(P>0.05)。复苏后大鼠皮肤色泽异常,眼球突出、眶周渗液,头埋于腹部,毛发竖起,极少活动,部分出现自残行为。随着时间增长,症状逐渐好转,3~5天左右,上述症状消失。
 
表2 大鼠基础状态(±s)
分组 体重(g) 心率(bpm) MAP(mmHg)
Sham24 395.50±23.55 392.33±21.36 150.33±9.77
Sham72 387.83±25.58 395.17±23.81 149.33±5.54
Sham168 390.83±23.49 406.67±22.48 147.00±8.34
CA24 383.16±13.85 406.17±31.10 148.00±8.79
CA72 386.17±22.23 405.83±34.45 146.67±9.37
CA168 395.50±27.46 412.33±32.88 146.67±9.87
ADSCs24 385.67±26.35 399.5±25.36 151.00±7.37
ADSCs72 403.33±35.47 411.17±32.47 148.33±11.03
ADSCs168 395.16±25.14 403.33±43.11 150.00±12.65
 
  表3 大鼠复苏指标(±s)
窒息时间(s) 按压时间(s) 复苏后1小时MAP(mmHg)
CA24 296.83±39.04 111.67±31.41 113.44±14.38
CA72 279±29.64 128.67±33.39 117.44±16.33
CA168 302.33±38.34 114.67±18.78 118.22±10.78
ADSCs24 275.17±38.22 128±38.34 112.89±16.94
ADSCs72 285±41.23 116.5±19.34 110.11±9.14
ADSCs168 294.33±44.57 107.33±21.55 119.56±4.66
(二)神经缺损功能实验
Sham组大鼠神经功能正常,评分均为80分。CA组和ADSCs组大鼠在复苏后脑干功能基本正常,出现不同程度的神经功能缺损:运动功能障碍(抓力减弱)、感觉功能障碍(痛觉减退)、平衡功能障碍及癫痫发作(部分性、全身性),其中CA组7只大鼠出现了全面性癫痫发作,而ADSCs组仅2只出现全面性癫痫发作。随着时间增长,神经功能逐渐好转,癫痫症状一般在3天内消失,运动功能及感觉功能恢复缓慢,至实验观察期结束,大部分大鼠仍存在运动功能、感觉功能及平衡功能障碍。
在术后24小时,CA组和ADSCs组大鼠神经功能缺损评分低于sham组,差异具有统计学意义(P<0.05),ADSCs组大鼠评分高于CA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。术后72小时,CA组和ADSCs组评分较前上升,但仍低于sham组,差异具有统计学意义(P<0.05),ADSCs组评分高于CA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。术后168小时,CA组和ADSCs组评分进一步上升,仍低于sham组,差异具有统计学意义(P<0.05),ADSCs组评分高于CA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
 
图3、3组大鼠各个时间点神经功能缺损评分(Neurological deficit score,NDS)
*P<0.05,相同时间点与sham组比较;#P<0.05,相同时间点与CA组比较。
(三)病理变化
HE染色后,显微镜下观察大鼠海马组织CA1区病理变化(图4)。Sham组大鼠海马区细胞形态基本正常,锥体细胞排列紧密。CA组大鼠海马区细胞出现锥体细胞减少,部分细胞核出现皱缩坏死,锥体细胞稀疏,大量小胶质细胞增生。ADSCs组大鼠海马区少量细胞核皱缩改变,锥体细胞排列基本正常,伴有小胶质细胞浸润。
 
图4、3组大鼠各个时间点海马组织CA1区病理变化(200×)。
a、b、c、细胞形态正常,锥体细胞排列紧密;d、海马区锥体细胞大量皱缩至坏死,核膜凹凸不整,模糊不清,核内染色质出现小而不规则凝块、边缘聚集,如黑色箭头所示;有大量小胶质细胞浸润,如红色箭头所示;e、海马区锥体细胞减少,部分细胞核呈现皱缩改变,核膜凹凸不整,模糊不清,并出现局部断裂,核内染色质出现小而不规则凝块、边缘聚集,如黑色箭头所示;有少量小胶质细胞浸润,如红色箭头所示;部分神经元空泡化,如黄色箭头所示;f、海马区锥体细胞减少,锥体细胞稀疏、排列紊乱。部分细胞核呈现皱缩改变,如黑色箭头所示;出现红色神经元,神经细胞核固缩,胞体缩小变形,尼氏小体消失,胞浆呈深伊红色,如红色箭头所示;g、海马区锥体细胞排列基本正常,部分锥体细胞核呈现皱缩改变,核膜凹凸不整,模糊不清,核内染色质出现小而不规则凝块、边缘聚集,如黑色箭头所示;部分神经元空泡化,如黄色箭头所示;h、海马区锥体细胞排列基本正常,部分锥体细胞核呈现皱缩改变,核膜凹凸不整,模糊不清,核内染色质出现小而不规则凝块、边缘聚集,如黑色箭头所示;有大量小胶质细胞浸润,如红色箭头所示;i、海马区锥体细胞排列基本正常,锥体细胞深染,小胶质细胞浸润,如黑色箭头所示。
(四)海马神经元凋亡率
TUNEL染色后,显微镜下观察海马CA1区神经元凋亡情况(图5、图6),凋亡细胞核固缩呈棕褐色,为圆形,新月形或不规则形。在光镜400倍视野下,每张切片随机选取5个不重叠视野(记数至少800个细胞),拍照时让组织充满整个视野。应用Image-Pro Plus6.0软件对每张照片进行分析得出阳性细胞的比率(阳性细胞数/总细胞数)即为凋亡率。Sham组大鼠海马神经元凋亡较少,神经元凋亡率极低。CA组神经元细胞数明显减少,ADSCs组神经元细胞数轻度减少,与HE染色结果一致。在复苏后24小时,CA组和ADSCs组大鼠神经元出现大量凋亡凋亡,凋亡率高于sham组,差异具有统计学意义(P<0.01);ADSCs组神经元凋亡率低于CA组,差异具有统计学意义(P<0.01)。在复苏后72小时,CA组和ADSCs组大鼠神经元凋亡继续上升,处于高峰期,凋亡率高于sham组,差异具有统计学意义(P<0.01);ADSCs组神经元凋亡率低于CA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。在复苏后168小时,CA组和ADSCs组大鼠神经元凋亡减少,凋亡率仍高于sham组,差异具有统计学意义(P<0.05);ADSCs组神经元凋亡率低于CA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
 
图5、海马组织TUNEL染色(200×)
 
 
图6、海马神经元凋亡率(hippocampal neuronal apoptosis rate)
*P<0.01,相同时间点与sham组比;**P<0.05,相同时间点与sham组比;#P<0.01,相同时间点与CA组比较;##P<0.05,相同时间点与CA组比较。
 
(五)血清S100B浓度
ELISA法检测血清S100B浓度(图7)。Sham组大鼠血清S100B浓度一直稳定于较低水平;CA组和ADSCs组S100B浓度升高,呈缓慢下降趋势。复苏后24小时,CA组和ADSCs组血清S100B浓度处于高峰期,高于sham组,差异具有统计学意义(P<0.01);ADSCs组S100B浓度低于CA组,差异具有统计学意义(P<0.01)。72小时,CA组和ADSCs组血清S100B浓度较前下降,仍高于sham组,差异具有统计学意义(P<0.01);ADSCs组S100B浓度低于CA组,差异具有统计学意义(P<0.01)。168小时,CA组和ADSCs组血清S100B浓度进一步下降,但仍高于sham组,差异具有统计学意义(P<0.01);ADSCs组S100B浓度低于CA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
 
图7、血清S100B浓度
*P<0.01,相同时间点与sham组比较;#P<0.01,相同时间点与CA组比较;&P<0.05,相同时间点与CA组比较。
 
(六)海马组织IL-6、BDNF蛋白水平
使用western blot方法检测3组大鼠各个时间点海马组织中IL-6(图8)、BDNF(图9)蛋白水平。
Sham组大鼠海马IL-6蛋白表达处于较低水平;经历心搏骤停的CA组和ADSCs组大鼠IL-6蛋白表达出现不同程度的上调。复苏后24小时,CA组和ADSCs组IL-6蛋白表达上调,高于sham组,差异具有统计学意义(P<0.01);ADSCs组IL-6表达强度高于CA组,差异具有统计学意义(P<0.01)。复苏后72小时,CA组和ADSCs组IL-6蛋白表达强度较前下降,仍高于sham组,差异具有统计学意义(P<0.01);ADSCs组IL-6表达强度高于CA组,差异具有统计学意义(P<0.01)。复苏后168小时,CA组和ADSCs组IL-6蛋白表达强度进一步下降,仍高于sham组,差异具有统计学意义(P<0.01);ADSCs组和CA组IL-6比较差异无统计学意义(P>0.05)。
Sham组大鼠海马BDNF蛋白表达稳定于较低水平;经历心搏骤停的CA组和ADSCs组大鼠BDNF蛋白表达出现不同程度的上调。复苏后24小时,CA组和ADSCs组BDNF蛋白表达上调,高于sham组,差异具有统计学意义(P<0.01);ADSCs组BDNF表达强度高于CA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。复苏后72小时,CA组BDNF表达强度快速下降,与sham组相比差异无统计学意义(P>0.05),ADSCs组BDNF下降缓慢,蛋白表达强度高于sham组和CA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。复苏后168小时,3组BDNF蛋白表达强度接近,两两比较差异无统计学意义(P>0.05)
 
 
图8 海马组织IL-6蛋白表达强度
*P<0.01,相同时间点与sham组比较;#P<0.01,相同时间点与CA组比较;&P>0.05,相同时间点与CA组比较。
 
 
 
 
图10 海马组织BDNF蛋白表达强度
*P<0.01,相同时间点与sham组比较;#P>0.05,相同时间点与sham组比较;##P>0.05,相同时间点与CA组比较;&P<0.05,相同时间点与CA组比较。
四、讨论
(一)、ADSCs对缺血缺氧性脑病的治疗效果
从神经功能实验、病理学、海马神经元凋亡、血清S100B四个方面对治疗效果进行综合评价。
NDS评分包括一系列的神经功能性实验,反应神经功能缺失程度,常用于心搏骤停后判断神经功能损伤程度及预测预后[25],当NDS<60分,提示预后不良,NDS≥60分,提示预后良好[25]。CA组在复苏后表现出严重的神经功能障碍,NDS评分仅为54.17±4.96,提示预后不良,在注射后24小时,就可以观察到ADSCs能减轻心搏骤停后的神经功能损伤,表现为癫痫全面发作少,运动功能、感觉功能减退较轻,NDS评分为61.67±3.33,预后较好。而在后期的观察中,ADSCs组神经功能恢复更好更快,表现为四肢抓力及痛觉能快速改善,平衡木试验坚持时间长,在3个时间点ADSCs组大鼠评分均高于CA组,说明ADSCs能减轻心搏骤停后的神经功能障碍,并快速促进神经功能恢复,改善预后。
海马组织对缺血缺氧极为敏感,光镜下CA组大鼠细胞核皱缩、锥体神经元坏死,尼氏体消失,在168小时可见明显的锥体神经元缺失,存活的神经元排列稀疏,小胶质细胞浸润,说明心搏骤停引起大量的神经细胞坏死,存在神经细胞明显缺失现象。ADSCs组存在轻度的细胞核皱缩、锥体神经元坏死,在168小时,锥体细胞排列基本正常,没有明显的锥体细胞缺失现象。TUNEL染色可直接反应神经元凋亡情况。在复苏后1~3天,神经细胞处于凋亡高峰期,可观察到大量棕褐色的凋亡细胞,第7天凋亡现象明显减轻,ADSCs干预后,在24小时就可以观察到神经细胞凋亡数减少,在观察期内神经细胞凋亡率始终低于CA组,说明ADSCs能快速起效,抑制神经细胞凋亡,促进神经细胞存活,减少神经细胞凋亡。
S100蛋白分子量较小,9~14kDa,生理情况下以不同的二聚体结构出现,属于细胞内钙结合蛋白家族,主要存在于成熟的血管周围的星形胶质细胞,在中枢神经系统的成熟少突胶质细胞、树突细胞、雪旺细胞中也有少量表达。在中枢神经系统,S100蛋白主要以同源二聚体S100BB或异源二聚体S100AB存在,这两种结构一起组成了S100B蛋白。近来的研究对S100B的生理功能及调节机制有了较深了解。在细胞内,S100B促进细胞增殖、迁移,同时抑制细胞凋亡;在细胞外,S100B通过与晚期糖基化受体结合发挥多种生物学效应(有益或有害)[26]。研究发现,在成人血清中,S100B蛋白平均浓度是50ng/L,其生理学效应与浓度密切相关,低浓度时具有神经保护作用,高浓度时具有神经系统毒性[27]。细胞外高浓度的S100B能刺激星形胶质细胞和小胶质细胞招募、分泌促炎因子、一氧化氮(nitric oxide,NO),最终导致细胞死亡[26]。心搏骤停出现后,大脑在一定时间内处于无灌注或者低灌注阶段,损伤的神经细胞释放S100B增多,血脑屏障功能受损,导致S100B入血增多,在心肺复苏病人中,复苏后6小时就可检测到血液中S100B快速上升。研究发现,心搏骤停患者血清S100浓度能反应神经损伤程度,可用于预测神经系统功能预后,浓度越高,提示神经功能预后越差,且预测准确性优于神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)[28, 29]。本实验中,正常大鼠S100B血清浓度接近正常成人血清浓度,心搏骤停后血清S100B快速上升,于24小时达到最高值,而ADSCs大鼠血清S100B浓度始终低于CA组,说明ADSCs组大鼠神经损伤比CA组轻,预测神经功能预后更好。
综上所述,心搏骤停后大鼠出现了NDS评分下降,神经细胞凋亡和神经细胞缺失现象,神经功能预后差,ADSCs能迅速发挥作用,提高NDS评分,抑制神经细胞凋亡,促进神经细胞存活,减轻神经细胞缺失现象,改善神经功能预后。
(二)、ADSCs减轻神经损伤的机制
研究显示,在神经缺血损伤早期注射ADSCs或者不含细胞的上清液,都能减轻神经损伤,保护神经细胞存活[30, 31],在脑损伤早期ADSCs极有可能是通过分泌功能减轻神经损伤促进神经细胞存活,在后期恢复期通过神经样分化及神经替代作用改善神经功能[32]。我们在复苏后早期进行ADSCs干预,观察海马组织中BDNF蛋白和炎症介质IL-6的变化。
BDNF是神经营养因子家族的重要成员,对神经元的发育、存活和凋亡起重要作用。BDNF在下丘脑中合成,在成长中及成年哺乳动物脑中广泛表达,与受体原肌球蛋白相关激酶B(tropomyosin-related kinase receptor type B,TrkB)具有高度特异性,结合后形成二聚体,并促使TrkB细胞内结构域的酪氨酸残基发生自体磷酸化,激活下游PI3K/AKT、MAPK、PLCγ等细胞内通路,发挥多种有益的生物学效应[33]。BDNF还能与低亲和力P75受体结合,诱导细胞凋亡[33]。在我们的研究中,心搏骤停后CA组大鼠海马组织BDNF表达上调,可能是经历缺血缺氧损伤后,自身保护机制启动,内源性BDNF分泌增多,而注射了ADSCs的大鼠海马组织BDNF蛋白水平明显高于CA组。ADSCs可以通过上调BDNF神经活性依赖性启动子,激活BDNF门控转录因子和cAMP反应元件结合蛋白[34],快速分泌BDNF。目前认为BDNF具有显著的神经保护作用,能减轻神经损伤。缺血再灌注损伤激活多种细胞死亡程序,如坏死、凋亡、自噬性死亡,抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)能调控内源性凋亡通路和线粒体通路,抑制凋亡[35]。BDNF能上调Bcl-2,抑制细胞内钙超载,抑制神经元凋亡[35, 36]。复苏后,兴奋性氨基酸释放增加,谷氨酸盐堆积至中毒水平,BDNF能抑制NO的细胞毒性,从而减轻谷氨酸盐介导的神经毒性作用,这一作用效果与BDNF蛋白浓度具有相关性[33]。ADSCs上调BDNF表达,BDNF通过上述机制发挥神经保护作用,减少神经凋亡。在实验中随着时间增长,BDNF表达水平逐渐下降,在7天时与正常大鼠无明显区别,说明早期单次注射ADSCs无法持续维持BDNF在高浓度状态,而多次小剂量注射ADSCs能否维持高浓度的BDNF并有更好的神经功能预后,需要进一步研究。
IL-6是炎症反应中重要的炎症介质,具有抗炎和促炎的双向调节作用,随着研究的深入,人们发现IL-6生物学不仅仅局限于免疫系统,在造血系统、急性期反应、心血管系统、神经系统、内分泌系统中同样有重要作用[37]。在中枢神经系统,小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经细胞都能分泌IL-6,在生理情况下,IL-6能诱导交感神经向胆碱能表型发展,促进神经再生、小胶质细胞及星形胶质细胞增生,维持血脑屏障的完整性[37]。在缺血缺氧性脑病发生后,抗炎观察到IL-6在血清及脑组织中快速上升,IL-6在其中的作用仍存在一定的争议。有些研究认为IL-6能加重炎症反应、促进细胞凋亡,加重已存在的神经损伤[38, 39]。本实验中,注射了ADSCs的大鼠海马组织中有更高的IL-6浓度,神经元凋亡数量少,神经评分高,因此推测IL-6具有一定的神经保护作用,这一结果与其它研究相似,移植ADSCs后IL-6在脑组织中表达升高[39],IL-6有积极的脑保护作用[40-43]。研究显示,ADSCs能分泌IL-6,上调IL-6R受体,与受体结合后的复合物能激活STAT3信号通路,上调下游抗凋亡蛋白髓细胞白血病1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表达,同时上调锰超氧化物歧化酶((Mn-superoxide dismutase,Mn-SOD)清除有害物质,抑制细胞凋亡[40, 42]。而靶向沉默IL-6基因后,ADSCs分泌IL-6明显减少,下游蛋白Bcl-2基因表达减少,神经细胞凋亡增多[40],说明ADSCs可以通过上调IL-6表达减轻炎症反应,抑制神经细胞凋亡现象。在缺血性脑病中,IL-6调控炎症介质的分泌,能减少多种促炎因子分泌,如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),降低髓过氧化物酶活性;IL-6还能抑制基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein,MMP-9)活性,维持血脑屏障的完整性,减少渗漏[43]。目前研究已发现IL-6与缺血性脑病多种相关机制,但仍有许多地方未阐明,IL-6在炎症中的作用是双向的,而促炎、抗炎两种作用之间的调节机制尚不清楚,值得进一步研究。
综上所述,BDNF、IL-6能抑制神经细胞凋亡,而ADSCs可能通过上调BDNF、IL-6的表达来减轻神经损伤、促进神经存活。
五、结论
心搏骤停能引起神经凋亡、严重的神经功能障碍,ADSCs具有神经保护作用,抑制神经细胞凋亡,改善神经功能预后。ADSCs可能是通过上调BDNF、IL-6表达发挥神经保护作用。
全文小结
1.本实验从人脂肪组织中分离并培养出稳定的ADSCs,从细胞形态、细胞表面抗原、多向分化能力3个方面对细胞进行鉴定,符合MSCs鉴定标准。
2. 心搏骤停能引起神经凋亡、严重的神经功能障碍,ADSCs具有神经保护作用,抑制神经细胞凋亡,改善神经功能预后。ADSCs可能是通过上调BDNF、IL-6表达发挥神经保护作用。
 
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脂肪间充质干细胞治疗缺血性脑病的研究进展
巩博 综述 李文放 审校
缺血性脑病是由低血压、心搏骤停、失血、窒息、溺水等原因引起局部或全脑血供不足导致的缺血性损伤,有着极高的致死、致残率。尽管近些年亚低温治疗、神经保护药物上取得了一些进步,但病人的出院率及生活质量仍不高,主要原因是缺血后不可逆的神经损伤导致偏瘫、植物人状态等神经系统后遗症甚至导致死亡,在复苏成功的患者中约28~34%遗留明显的神经功能障碍(CPC评分>1)[1],约10%患者遗留严重神经功能障碍(CPC评分>2),其中高龄、女性、非白种人、高疾病负担、周末发生的疾病与神经功能障碍密切相关[2]。缺血再灌注损伤是缺血性脑病基本病理机制。当大脑处于无灌注阶段,细胞内钙超载、内皮损伤、兴奋性氨基酸的神经毒性、中性粒细胞及血小板活化等因素引起缺血性损伤,灌注恢复后,神经损伤进一步加重,与无复流现象、钙超载、自由基、炎性介质大量释放有关[3, 4]。缺血时间越长,重灌注损伤越重,组织损伤也越严重。如何实施有效的脑保护,减轻神经损伤,促进损伤神经元修复,恢复神经功能已成为缺血性脑病研究的重点和难点。
上世纪70年代,Friedenstein等首次证实了在骨髓中存在非造血干细胞,在随后的研究中,逐渐发现了其多向分化潜能及低免疫原性。由于上述优点,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)迅速成为治疗神经损伤研究的热点,成为间充质干细胞在再生医学研究中的标杆。然而BMSCs存在一些不足:提取率低,BMSCs仅占骨髓内细胞总数的0.001%~0.01%,并随年龄增长细胞数逐渐下降[5];取材过程痛苦;分化能力也随着年龄增长出现下降[6]。2001年,Zuk等[7]首次从抽脂术抽取的脂肪组织中分离培养出脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived stem cells,ADSCs),发现其具有与BMSCs相似的生物学特性及多向分化潜能[8],并有其独特的优点:肥胖人群日渐增多,脂肪组织来源丰富;取材方便痛苦小;脂肪组织中ADSCs获得率高,至少为BMSCs的20~40倍;另一方面ADSCs具有与BMSCs相似的治疗效果,因此ADSCs很有可能替代BMSCs,成为再生医学新的干细胞来源。本研究对ADSCs的生物学特点及其在缺血性脑病中的应用及研究进展做一综述。
一、ADSCs生物学特点
综合文献报道,1g脂肪组织中可获得0.5×106~2×106SVF,SVF经过培养分离可获得1%的ADSCs(0.5×104~2×105),提取率差异主要与性别、体重指数、脂肪类别(黄色脂肪、棕色脂肪)、收集及培养方法有关[9]。和其它来源的MSCs类似,ADSCs表达间充质干细胞特异性表面抗原,如CD90、CD105、CD73,不表达造血干细胞表面抗原,如CD45、CD34[10, 11],不表达HLA-DR。ADSCs具有与BMSCs相似的多向分化能力,能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞,并且分化、增殖能力稳定,不会随供者年龄增长出现明显下降趋势[6, 12]。与BMSCs相比,ADSCs在分泌功能、增殖能力、免疫调节功能等方面具有优势[13, 14]。
二、ADSCs减轻缺血性脑损伤的机制
(一)归巢现象
    归巢是指MSCs在在多种因素作用下,定向性迁移越过血管内皮细胞至靶向组织,并定植存活的过程。在大鼠大脑中动脉梗塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)中,通过颈内动脉或外周静脉注射ADSCs,发现ADSCs能穿越血脑屏障迁移至脑损伤区域[15-17]。归巢现象的机制目前尚不清楚,可能与基质细胞衍生因子-1α/趋化因子受体4(SDF-1α/CXCR4)轴有关。目前研究认为,SDF-1α是促进ADSCs迁移的关键因子,损伤部位SDF-1α表达增加或者ADSCs过表达SDF-1α都能促进ADSCs向损伤部位的迁移[18, 19],而CXCR4抑制剂AMD3100能抑制迁移能力[20]。细胞通路方面,丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)途径(包括ERK、JNK、P38通路)在ADSCs迁移中起重要作用能促进ADSCs的迁移能力,其它与迁移相关的通路还有PI3K/AKT通路、Ras同源基因家族、血小板衍生生长因子-BB/血小板衍生生长因子受体β通路[21]等。
(二)旁分泌功能
ADSCs能分泌多种营养因子,这些因子多为水溶性,在脑损伤部位发挥保护及修复作用。目前研究较多的有:脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)及神经生长因子(nerve growth factor,NGF)具有促进新的神经元分化及强大的保护受损神经元的作用[22-25];血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是促进血管再生的关键因子,能促进损伤部位的血管再生,改善损伤部位血液供应[26, 27]。ADSCs上清液含有多种因子,单独注射上清液同样具有脑保护作用,目前研究已经证实,在大鼠缺血缺氧性脑病模型中注射上清液(无ADSCs细胞),发现神经细胞凋亡及胶减少,胶质细胞增生减轻,促进新血管形成、脑功能恢复[28, 29],说明ADSCs分泌的因子具有强大的神经保护及神经修复作用。而不同来源的MSCs分泌的因子存在一定的差异,在某些蛋白(成纤维细胞生长因子、干扰素-γ等),ADSCs的分泌功能优于BMSCs[14]。
近些年来,外泌体是生物科学研究中的研究热点。研究发现MSCs分泌的外泌体包含多种蛋白及功能性微小RNA,而外泌体在MSCs与细胞之间的通信及功能调节中起重要作用。Chen等在脑梗大鼠注射ADSCs分泌的外泌体,发现促炎因子表达减少,神经细胞凋亡减少,脑水肿减轻,脑梗面积明显减少[30]。而不同来源的MSCs外泌体成分也存在差异,其分泌的外泌体成分的差异及在脑损伤治疗中治疗效果的差异值得进一步研究。
(三)免疫调节作用
神经炎症介质在缺血性脑损伤病理过程中起关键作用,在脑损伤后数小时内,就会出现大量的炎症介质粘附于受损部位的内皮细胞,这些炎症介质能加重已存在的神经损伤或者在神经修复中起积极作用。ADSCs具有强大的免疫调节能力。在体外实验中已经证实,ADSCs能抑制单核细胞增殖,并调节白介素6、转化生长因子-1的浓度[13]。在动物实验中,ADSCs能下调促炎因子(白介素18、肿瘤坏死因子α、toll样受体4等),同时上调抗炎因子(白介素8、Bcl-2蛋白等),减轻炎症反应[13, 16, 31, 32]。其潜在作用机制目前并不明了,可能是通过ADSCs通过与细胞的直接接触及分泌可溶性因子共同作用来发挥一系列效应。
(四)神经分化及内源性神经再生
脑缺血性损伤在多种机制的作用下导致缺血部位神经元及神经胶质细胞凋亡、坏死,而神经细胞再生能力非常有限,难以替代受损神经元。近年来研究发现,ADSCs除了能向中胚层组织分化,还具有跨胚层向神经细胞分化的能力,即横向分化能力。目前其分化机制目前并不完全清楚,可能与细胞所处的微环境有关。2002年Safford等首次发现,在一定环境下ADSCs(传代4~5代)可分化成类神经元样细胞,并表达神经巢蛋白、核蛋白等神经表型,在开始诱导后1~3小时,ADSCs就可以出现阳性神经表型[33]。在随后的体外实验中发现,多种因素及条件(富含血小板的血清[34]、人参皂苷Rg1[35, 36]、神经营养因子[37]、催产素[38]等)均可诱导ADSCs向神经样细胞分化。在动物实验中,同样发现了ADSCs向神经样细胞分化现象。在脑缺血大鼠,无论颅内定位注射或外周血管注射ADSCs,都在脑损伤区域发现了ADSCs,表达巢蛋白、核蛋白等神经表型[17, 39]。在上述实验中,多种物质均能诱导ADSCs向神经样细胞分化,而这些物质可能通过激活或失活某些细胞内与细胞增殖分化相关的信号通路来诱导神经样分化[40],研究发现激活MAPK/ERK通路、Wnt通路、视黄酸通路能促进MSCs神经样分化[41-44]。而ADSCs分化的神经样细胞与宿主神经细胞之间的是否存在电活动及互相融合,需要进一步研究。
除了自身的神经分化,ADSCs还能促进内源性神经再生。研究证明,在成人大脑的侧脑室室下区(SVZ)及海马齿状回颗粒下层(SGZ)的神经细胞仍保持着一定的神经再生能力,如果能够大量激活SVZ、SGZ区域的神经干细胞,可以促进自身神经修复。注射ADSCs后,在SVZ、SGZ区观察到了神经元细胞的标志物,说明了原始神经细胞向神经细胞分化[16, 45, 46]。内源性神经再生机制可能与ADSCs分泌的BDNF、NGF促使原始神经细胞再分化有关[47]。
三、动物实验
动物缺血缺氧性脑病的模型主要为局灶性及全脑范围。局灶性缺血研究较多,为MCAO模型,全脑性缺血模型可由电击致室颤、窒息、失血、或大鼠长期处于缺氧环境模拟。ADSCs在上述动物模型的应用中均取得了良好的效果:能减少神经细胞凋亡、减少梗死面积、减轻脑水肿,改善神经评分[16, 22, 26, 48, 49]。而在ADSCs和BMSCs的对比研究中,两者的治疗效果无明显差异[50]。
脑缺血性损伤发生后,自身脑保护及修复机制立即启动,在早期注射ADSCs,可通过加强自身保护及修复机制保护脑细胞存活,减少脑损伤。在脑损伤慢性期注射ADSCs,机制可能为神经分化及神经替代作用。在缺血发生后30分钟及早注射ADSCs,能上调突触素、VEGF蛋白表达,在24小时就能观察到神经损伤减轻,并且在长达14天的观察期内一直具有脑保护作用[26]。而在另外一项试验中,研究人员在脑损伤后30天注射BMSCs,没有观察到有效的治疗效果[51]。结合目前研究结果,早期注射能通过多个环节保护脑神经,而治疗有效的时间窗尚未确定。
动物实验中采用较多的注射方式为静脉注射、动脉注射、颅内定位注射。在蛋白水平、迁移细胞数方面,颅内定位注射及动脉注射优于静脉注射,但前2种注射方式指标快速下降,在第7天3种注射方式在指标上无明显区别;在治疗效果方面3种注射方式无明显差异[52]。静脉注射方便快捷、损伤小,且可接受大剂量的药物注射,因此静脉注射在3种注射方式中是较好的选择。
四、安全性研究
ADSCs不表达HLA-DR,不会引起效应T细胞介导的免疫排异反应,目前无论在异体、异种ADSCs移植试验中,均未发现存在排异反应。肥胖是某些肿瘤的危险因素,增加发病率和病死率,如子宫内膜癌、乳腺癌、食管癌、大肠癌等。而ADSCs具有归巢、多向分化、分泌营养因子的特点,因此ADSCs的致瘤性是其安全性研究的关注点。对于已存在的肿瘤,ADSCs是否会定向迁移至病灶,分泌生长因子,促进肿瘤增殖、浸润及远处转移?对于无肿瘤的病人,ADSCs是否会诱导新发肿瘤?目前的研究对于ADSCs的致瘤性尚无统一结论。Feng等发现,ADSCs向胶质细胞瘤迁移,但是在体外ADSCs不会分化为肿瘤相关的成纤维细胞,在体内ADSCs并不具有致瘤性,反而促进低分化肿瘤细胞向高度分化[53]。而另外的研究认为,ADSCs能促进乳腺肿瘤、结肠癌发生,机制可能是通过分泌白介素6激活肿瘤细胞内的JAK2/STAT3信号通路[54]。目前研究倾向于ADSCs对与肥胖相关的肿瘤如子宫内膜癌等有致瘤性[55, 56],对其它类型的肿瘤是否具有相同的致瘤性需要进一步研究。
 五、临床试验
MSCs细胞治疗作为一种新的治疗方法,在多种疾病的动物实验中取得了较好的治疗效果,已经开展了关于多种疾病的临床实验,如缺血性中风、心梗、帕金森病、克隆恩病、脊髓损伤、移植抗宿主病等。目前在clinicaltrials.gov查询到的ADSCs治疗缺血性脑病的临床试验见表1。
 
表1 临床试验
注册号 疾病 干预措施 试验阶段 研究中心
NCT02813512 缺血性中风 ADSCs/安慰剂 临床1期 单中心
NCT01678534 缺血性中风 ADSCs/安慰剂 临床2期 单中心
NCT02849613 缺血性中风 ADSCs/安慰剂 临床2期、3期 多中心
NCT01453829 缺血性中风 ADSCs 临床1期、2期 单中心
    
临床试验关注点在ADSCs治疗缺血性脑病的有效性及安全性,研究对象多为60~80岁病人,注射剂量为1×106细胞/kg,注射方式为静脉注射或颈内动脉注射,注射时间为中风后1天至14天不等,观察时间6个月至2年不等。其中值得关注的是RESSTORE试验(NCT02849613),在欧洲开展的多中心临床试验,采用随机、双盲、平行对照的试验设计,计划招募试验病人400人(梗死直径>1.5cm、NIHSS≥7),重点观察ADSCs对于缺血性中风的治疗效果,计划于2020年9月完成。而另一项研究(NCT01678534)注重观察ADSCs在临床治疗中的安全性,观察24个月内出现的相关副作用及并发症。
尽管ADSCs在许多动物实验中,并取得了良好的效果,但是临床试验并不多,均为局灶性脑缺血,且大部分是6~20人的小样本量研究。究其原因,可能因为ADSCs的作用机制及致瘤性研究尚未完全明了。目前开展的临床试验仅RESSTORE试验为多中心、大样本临床研究,但研究对象单一,缺乏对心搏骤停、窒息、失血等其他原因引起的全脑范围缺血的研究,需要开展更多的大样本、多中心的临床试验,纳入更多的病人及病例,从多角度研究临床应用的有效性及安全性。
六、移植方案假设
ADSCs移植可采用自体移植方案,同时也可采用由健康志愿者捐献脂肪的异体移植方案。自体移植方案从患者自身抽取脂肪,经过消化、分离、培养、纯化、传代,需要传代3~6次才可能得到临床治疗需要的细胞,此过程耗时较长,可能需要长达4周的准备时间。ADSCs低表达MHC I类抗原,不表达MHC II类抗原和共刺激分子CD40、CD80y、CD86,具有免疫调节和免疫豁免的特性,此特点使异体甚至异种移植成为可能。异体移植方案从健康供者抽取脂肪,经过上述步骤培养传代3~6次后,将培养好的细胞放入冻存液在-80℃~-160℃冻存。待患者需要使用时,再快速解冻复温、培养并传代,准备时间可缩短至7天左右。且动物实验结果提示人来源的ADSCs对大鼠缺血性脑病的具有较好的治疗效果[30],且与同种来源ADSCs治疗效果无明显差异[26],为临床异体移植提供一定的理论基础。但是在应用前仍有许多问题需要解决:①脂肪类型、脂肪采集的部位、采集方法、供者的体重、健康状态等许多因素都可能影响ADSCs的质量,需要对供者、采集过程进行统一;②根据文献报道,脂肪组织的处理、培养过程中使用的消化酶、培养基等试剂及操作步骤答题相似,但仍存在一定的差异,需要对培养过程中使用的试剂、操作进行统一;③在ADSCs应用的相关指南,通用的标准仍为2006年提出的MSCs的最基本定义,随着研究深入发现ADSCs有自身独有的特性,需要升级ADSCs的鉴定标准;④注射途径,除了上述的颅内定位注射、动脉注射、静脉注射,还有鞘内注射。鞘内注射安全风险较小,但仍存在操作繁琐、易致脊髓损伤等缺点。静脉注射安全、快捷,可大剂量反复注射,存在ADSCs归巢数量少的特点,部分细胞被肺毛细血管网捕获,但动物实验发现静脉注射、颅内定位注射治疗效果无明显差异,因此,静脉注射似乎是较好的选择;⑤在ADSCs的培养过程中需要繁琐的人工操作,易混入其它细胞甚至真菌导致污染,因此需要经过培训的特定工作人员,多个环节都需要对ADSCs进行多次鉴定,检测其生物学特性、特异性抗原、多向分化潜能,检查无菌性。
目前研究证明了在缺血性脑病模型中注射ADSCs能保护受损神经,减少神经元凋亡,并促进神经功能恢复,然而依然有许多问题需要解答:最佳注射途径、治疗的时间窗、作用机制、与肿瘤关系等。在临床研究方面,多中心、大样本临床试验较少,对缺血性脑病的治疗效果、安全性需要进一步确认。
 
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